Исследование раскрывает механизмы устойчивости бактерий и мишени для антибиотиков
Ученые из Калифорнийского университета в Сан-Франциско (UCSF) и Стэнфордского университета провели первое комплексное исследование ключевых генов и белков, необходимых для жизни бактерий. Исследование, сочетающее новую версию технологии редактирования генов CRISPR с автоматизированной микроскопией клеток, позволило лучше понять фундаментальные генетические сети, которые делают бактерии устойчивыми к стрессу и — всё чаще — к антибиотикам. Работа также продемонстрировала практический подход к определению механизма действия потенциальных новых антибиотиков, что может помочь в разработке более эффективных препаратов для борьбы с растущей эпидемией устойчивости к антибиотикам.
Новый подход к изучению жизненно важных генов
Изучение функций самых важных генов ранее было сложной задачей, поскольку их полное "выключение" (knockout) приводит к гибели клетки. Команда под руководством Кэрол Гросс (UCSF), К.С. Хуанга и Стэнли Ци (Стэнфорд) использовала новую технику "подавления" генов (knockdown).
Метод, названный CRISPR-интерференция (CRISPRi), был разработан Стэнли Ци. В отличие от CRISPR-Cas9, которая разрезает ДНК, CRISPRi позволяет точно регулировать ("приглушать") производство конкретных белков в клетке, не уничтожая её.
Эксперимент и ключевые результаты
Исследователи использовали CRISPRi, чтобы системно снизить производство каждого из 258 жизненно важных белков у бактерии Bacillus subtilis. Состояние ослабленных клеток анализировали с помощью автоматизированной микроскопии.
- Полная потеря белка вызывала серьезные нарушения: деформацию формы, разрыв клетки или остановку роста.
- Частичное подавление (knockdown) выявило более тонкие изменения и
разделило белки на два класса:
- Те, что напрямую контролируют форму клетки через клеточную стенку.
- Модуляторы, влияющие на форму косвенно.
"Эти результаты раскрывают новый набор уязвимостей, на которые могут нацеливаться антибиотики", — отметил К.С. Хуанг.
Генетическая избыточность как основа устойчивости
Команда также подвергла каждую "подавленную" линию более чем 100 различным стрессам (антибиотики, изменение питания). Анализ почти 30 000 комбинаций позволил выявить ключевые принципы устойчивости бактерий:
- Избыточное производство: Бактерии производят больше критически важных белков, чем нужно, создавая "неприкосновенный запас" на случай голода.
- Дублирующие системы (fail-safe): У многих белков есть функциональные "запасные" варианты, что позволяет клетке выдерживать генетические мутации или атаки лекарств.
Яркий пример: три белка, критически важных для создания защитного внешнего слоя клетки. Подавление каждого по отдельности не вредило клетке. Клетка погибала только при одновременном подавлении всех трёх белков. Было обнаружено множество пар белков с разными функциями, обеспечивающих одинаковую устойчивость к стрессам.
"В некотором смысле эти эксперименты позволили нам провести обратную инженерию эволюции", — сказал Хуанг. — "Клетки оптимизированы для выживания в неблагоприятных условиях, что логично, учитывая частый дефицит питательных веществ в ходе их эволюции".
Платформа для разработки лекарств
Исследование показало потенциал метода CRISPRi для открытия новых антибиотиков. Ученые продемонстрировали, что подавление определенного фермента, важного для построения клеточной стенки, делало клетки особенно уязвимыми к антибиотику с неизвестным ранее механизмом действия. Такой подход может стать эффективным способом определения мишеней других препаратов, что является серьёзным препятствием на пути от лаборатории к клинике.
Исследование опубликовано онлайн в журнале Cell 26 мая 2016 года.