Наблюдение за белками в их естественной среде

Белки могут быть причиной того, что действующие вещества лекарств просто высвобождаются из клеток-мишеней. Теперь за этим процессом можно наблюдать.

Некоторые лекарства, например, используемые для лечения рака, теряют эффективность, потому что белки в мембране клетки-мишени просто выкачивают их обратно. Команде из Рурского университета в Бохуме (RUB) впервые удалось наблюдать ответственный за это транспортный белок в его естественной среде. Учёные пометили его небольшими последовательностями антител, к которым был присоединён контрастный агент. С помощью электронного парамагнитного резонанса (EPR), детектирующего спин металлического контрастного агента, они смогли сделать выводы о состоянии белка. Команда под руководством профессора Энрики Бординьон и доктора Лауры Галаццо из кластера передовых исследований Ruhr Explores Solvation Resolv в сотрудничестве с группой профессора Маркуса Зегера из Цюрихского университета сообщает о методе в журнале PNAS от 4 февраля 2020 года.

Поиск и связывание нанотел с белком

До сих пор мембранные белки можно было исследовать только изолированно — в мицеллах детергентов или in vitro созданных мембранных бислоях, что несёт риск потери их свойств и динамики, критически важных для функции. Команде из Resolv удалось наблюдать белок непосредственно в его естественной среде — в мембране бактерий Escherichia coli. «Там очень тесно и многолюдно», — описывает Энрика Бординьон. Хитрость команды заключается в использовании в качестве меток двух последовательностей антител размером всего в несколько нанометров, называемых нанотелами. «Мы используем именно те последовательности, которые могут распознавать и связываться с определёнными участками белка», — объясняет Лаура Галаццо.

Команда Маркуса Зегера занималась подбором правильных нанотел. «Благодаря разработанной нами платформе для отбора, которая обходит иммунизацию животных, любая лаборатория может быстро производить синтетические нанотела для любых целей. Это шаг к их использованию в структурной биологии, как показывает эта работа», — говорит Зегер.

Как сделать нанотела видимыми для EPR? Ионы гадолиния, используемые в качестве контрастного агента для магнитно-резонансной томографии и детектируемые EPR благодаря их электронному спину, были присоединены к двум выбранным нанотелам. Поскольку меченые нанотела ещё нельзя было эффективно ввести в бактерии, учёные использовали биохимический трюк: клетки E. coli были вывернуты наизнанку, так что внутренняя сторона мембраны оказалась снаружи. Таким образом, участки белка, на которые нацелены нанотела, стали доступными.

Сигнал только при определённой форме

«Нанотела немедленно связываются с конкретной последовательностью мембранного белка, которую они распознают, и больше не могут отсоединиться», — говорит Энрика Бординьон. Обработанные таким образом клетки затем были исследованы с помощью EPR. «Мы смогли получить сигнал только тогда, когда два нанотела находились в непосредственной близости друг от друга», — объясняет Лаура Галаццо. Это происходило именно тогда, когда белок принимает конформацию, выкачивающую активные вещества из клетки.

«Наша работа показывает, что мы можем успешно измерять расстояния в диапазоне от 1,5 до 6 нанометров в нативных мембранах», — говорит Энрика Бординьон. «Следующим шагом мы хотим ввести нанотела в бактерии, чтобы наблюдать за мембранным белком в действии в живых клетках». «Эта техника открывает невообразимые возможности», — говорит Лаура Галаццо.