TRAPping белков, работающих вместе внутри живых клеток

Исследователи разработали новый метод сшивания белков, достаточно компактный и нетоксичный для использования в живых клетках. Этот подход позволяет обнаруживать взаимодействия между белками, которые слишком кратковременны для других методов.

Проблема существующих методов

  • Ограниченность: Большинство кросслинкеров слишком велики, чтобы проникнуть в живые клетки, токсичны для них или связывают белки, которые просто находятся рядом, а не взаимодействуют функционально.
  • Нерелевантные условия: Методы работают в условиях, отличных от внутриклеточных, что не позволяет обнаружить все нормальные взаимодействия белков.

Новый метод TRAP

Ученые из Тихоокеанской северо-западной национальной лаборатории (PNNL) создали метод, в котором:

  1. В интересующий белок встраивается небольшая метка — "тетрацистеиновый мотив" (две пары аминокислоты цистеин).
  2. В живую клетку добавляется малая молекула TRAP, которая находит и связывается с этой меткой.
  3. С помощью вспышки света контролируемая "липкость" TRAP активируется, и молекула ковалентно присоединяется к белкам-партнерам, находящимся в непосредственной близости.
  4. TRAP содержит биарсеникальный зонд, который флуоресцирует, что позволяет идентифицировать "пойманные" белки с помощью последующего анализа.

Тестирование на РНК-полимеразе

Метод был опробован на хорошо изученном комплексе белков — РНК-полимеразе. Ученые встроили метку в C-конец альфа-субъединицы (хвост), который, как известно, контактирует с ДНК и вспомогательными белками перед началом транскрипции.

Результаты

  • Как и ожидалось, были обнаружены взаимодействия с известными вспомогательными белками (факторами транскрипции).
  • Новое открытие: Метка также была обнаружена на бета-субъединице ядра полимеразы. Это указывает на ранее неизвестный контакт между хвостом альфа-субъединицы и бета-субъединицей во время работы фермента.

"Никто не знает, как выглядит полимераза, когда она работает. Здесь мы видим, что C-конец откидывается назад, чтобы захватить бета-субъединицу, как только полимераза начинает работать", — пояснила биохимик Ульяна Майер (PNNL).

Перспективы метода

Метод успешно протестирован и на других белках (например, в молодых мышечных клетках). В будущем его планируют использовать для изучения того, как условия окружающей среды влияют на взаимодействие белков в крупных сетях.

Результаты опубликованы 15 июня в журнале ChemBioChem.