Разгадан механизм поиска мишени в бактериальной иммунной системе Cas9

Исследователи из Национальной лаборатории Лоуренса в Беркли и Калифорнийского университета в Беркли определили, как бактериальный фермент Cas9, направляемый РНК, идентифицирует и расщепляет чужеродную ДНК. Ключевую роль в этом процессе играют короткие последовательности ДНК — PAM (protospacer adjacent motif).

Основные функции PAM:

• Дискриминация «свой-чужой»: Наличие PAM рядом с мишенями в чужеродной ДНК и его отсутствие в геноме бактерии-хозяина позволяет Cas9 точно отличать ДНК, которую нужно уничтожить, от собственной, даже если их последовательности почти идентичны.
• Активация фермента: Присутствие PAM необходимо для активации нуклеазной активности Cas9.

Как это работает?

Cas9 не ищет вслепую уникальную последовательность из 20 пар оснований в огромном геноме. Вместо этого он сначала находит короткие PAM-последовательности, что резко ускоряет поиск цели и минимизирует время проверки нецелевых участков ДНК.

Методология:

Ученые использовали технологию «ДНК-занавесок» и микроскопию полного внутреннего отражения (TIRFM), чтобы в реальном времени наблюдать за отдельными молекулами Cas9, связывающимися с ДНК. Результаты визуализации подтверждены традиционными биохимическими методами.

Значение:

Понимание механизма поиска мишени ферментом Cas9 может улучшить методы генного таргетинга и редактирования генома в бактериях и других типах клеток. Cas9 является основным инструментом адаптивной иммунной системы бактерий CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) типа II для защиты от вирусов и плазмид, а также быстро становится ценным инструментом для генной инженерии и синтетической биологии.

«Наличие PAM обеспечивает две избыточные контрольные точки, которые гарантируют, что Cas9 не может по ошибке разрушить свою собственную геномную ДНК», — пояснил Сэмюэл Стернберг, ведущий автор статьи в Nature.