Ученые создали модель для анализа регуляции ceRNA и проверили ее на синтетических генетических цепях

Ученые из Университета Цинхуа (Пекин) исследовали перекрестную регуляцию конкурирующих эндогенных РНК (ceRNA). Для этого они создали вычислительную модель, количественно описали минимальную сеть ceRNA и экспериментально подтвердили ее предсказания с помощью многофлуоресцентных синтетических генетических цепей в культивируемых клетках человека (HEK293).

Ключевые выводы:

  • Факторы влияния: Эффект ceRNA зависит от обилия miRNA и ceRNA, количества и сродства сайтов связывания, а также пути деградации мРНК, определяемого степенью комплементарности miRNA–мРНК.
  • Роль уровня miRNA: Относительный уровень miRNA определяет режим (относительно уровня транскрипции ceRNA), в котором возникает эффект ceRNA. При высоком уровне miRNA для запуска эффекта ceRNA клеткам нужно больше молекул-мишеней.
  • Сайты связывания: Более прочное связывание miRNA с мишенями и большее количество сайтов связывания (MRE) усиливают эффект ceRNA, но не меняют режим его возникновения.
  • Невзаимная конкуренция: Обнаружен невзаимный (односторонний) конкурентный эффект между мишенями с частичной и совершенной комплементарностью. Это связано с разной скоростью потери miRNA (α) в двух типах репрессии:
    • miRNA-тип (частичная комплементарность): miRNA ингибирует трансляцию или вызывает дестабилизацию РНК. Скорость потери miRNA высокая.
    • RNAi-тип (совершенная комплементарность, siRNA): miRNA расщепляет мишень и может рециклироваться. Скорость потери miRNA низкая.
    • В экспериментах скорость потери для miRNA-типа репрессии оказалась примерно в 5 раз выше, чем для RNAi-типа.
  • Следствие для siRNA: Эффективность интерференции siRNA может значительно снижаться из-за off-target мишеней с высоким уровнем экспрессии и сильными сайтами связывания. Введение дополнительного количества siRNA может компенсировать эффект высокоэкспрессированных off-target, но не off-target с сильными сайтами связывания.

Методология:

  1. Разработана упрощенная математическая модель минимальной системы miRNA-ceRNA (один вид miRNA и две конкурирующие РНК-мишени).
  2. Создана и внедрена в клетки HEK293 соответствующая синтетическая генетическая цепь из пяти транскрипционных единиц с использованием транзиентной трансфекции.
  3. Уровни miR-21, ceRNA1 и ceRNA2 отслеживались с помощью трех флуоресцентных белков (iRFP, mKate и EYFP соответственно). Четвертый белок (TagBFP) использовался для учета вариаций в эксперименте.
  4. Количественный анализ работы цепи проводился с помощью проточной цитометрии.

Значение работы:

  • Для фундаментальной науки: Углубляет количественное понимание принципов регуляции конкурирующих РНК через miRNA.
  • Для синтетической биологии: Демонстрирует, что синтетические генетические цепи — мощный инструмент для изучения сложных клеточных систем в контролируемых условиях. Это может помочь в создании более предсказуемых генетических модулей на основе miRNA или ceRNA.
  • Для приложений: Полученные данные могут быть использованы для:
    • Улучшения инструментов предсказания сайтов связывания miRNA (например, алгоритма MIROR — miRNA Occupancy Rate) с учетом типа клеток.
    • Разработки стратегий дизайна siRNA для снижения off-target эффектов в клетках млекопитающих.