Открытие «скрытой жемчужины» позволило редактировать гены с помощью компактной, но мощной системы CRISPR-Cas3
Почти десять лет назад ученые открыли силу CRISPR — инструмента, который бактерии используют для защиты от вирусов. Теперь это фундаментальный инструмент для редактирования геномов. Один из самых популярных — CRISPR-Cas9, с помощью которого можно находить и вырезать или заменять целевые участки ДНК в клетке.
«Однако способность инструментов на основе Cas9 вносить масштабные, ген-размерные изменения действительно ограничена», — говорит Янь Чжан, доктор философии, доцент кафедры биологической химии Медицинской школы Мичиганского университета.
Здесь на помощь приходит другой инструмент — CRISPR-Cas3.
В 2019 году лаборатория Чжана была в числе первых, кто описал этот новый инструмент, способный к процессивной деградации ДНК и, следовательно, к удалению крупных участков генома. Средний размер человеческого гена — 10–15 килобаз, что хорошо укладывается в возможности CRISPR-Cas3.
Однако у системы были ограничения в эффективности, большом размере гена и сложности производства белка. В новой статье в журнале Molecular Cell старшие авторы Янь Чжан и Чжунган Хоу, аспирант Ренке Тан, магистрант Райан Крюгер и их команда с коллабораторами описывают, как они нашли «скрытую жемчужину», которая позволила использовать новые редакторы CRISPR-Cas3, преодолевающие эти ограничения.
В работе представлен первый пример миниатюрного редактора CRISPR-Cas3 из бактерии Neisseria lactamica, который значительно повышает эффективность редактирования, легче производится в виде рибонуклеопротеиновых реагентов и имеет более компактный общий размер гена, что упрощает доставку in vivo. Ранее, используя старую версию инструмента, «мы достигали лишь 10% редактирования в стволовых клетках и, возможно, 30–50% в клеточных линиях, полученных из раковых клеток».
Команда разработала CRISPR-Cas3 от N. lactamica, очистила его комплекс Cascade RNP и белок Cas3 и смогла достичь 50% эффективности редактирования в стволовых клетках и впечатляющих 95% в других человеческих клеточных линиях. Чтобы максимизировать полезность инструмента, они попытались создать метод экспрессии с использованием плазмид — небольших кольцевых молекул ДНК, которые позволяют обойтись без очистки белка. Однако созданные и доставленные плазмиды не работали.
Тан заметил неожиданную дополнительную белковую полосу на геле для очистки белков и в итоге выяснил, что это продукт внутренней трансляции — белок Cas11, без которого комплекс CRISPR-Cas3 не формируется и, следовательно, не выполняет редактирование в человеческой клетке.
«Этот тип белка Cas11 был похож на скрытую жемчужину, которую мы и другие исследователи заметили лишь недавно», — сказал Чжан.
Добавление этого белка с помощью отдельной экспрессионной плазмиды позволило производить Cas11 в человеческих клетках и обеспечило надежную работу плазмидной системы CRISPR-Cas3.
«Думаю, мы нашли версию инструмента CRISPR-Cas3, которой очень довольны», — заявил Чжан.
Опубликовав работу, команда разместила инструмент на платформе Addgene, чтобы исследователи могли использовать его для решения широкого круга научных задач — от удаления крупных генов, вызывающих заболевания, до изучения некодирующей части человеческого генома.
«Следующий этап для нас — применение CRISPR-Cas3 в моделях на животных и стволовых клетках для создания моделей заболеваний или изучения cis-регуляторных элементов плюрипотентности», — сказал Чжан.