CRISPR-Cas9 позволяет легко картировать генетические сети

CRISPR-Cas9 позволяет "выключать" или изменять один ген, чтобы определить его влияние на организм, клетку или другой ген. Учёные из Калифорнийского университета в Беркли разработали метод, позволяющий провести тысячи таких экспериментов одновременно: с помощью CRISPR индивидуально воздействовать на каждый ген в геноме и быстро оценивать влияние каждого из них на экспрессию интересующего гена.

Новый метод, названный CRISPR interference with barcoded expression reporter sequencing (CiBER-seq), позволяет комплексно профилировать клетку, включая человеческие клетки, и быстро определить все последовательности ДНК в геноме, регулирующие экспрессию конкретного гена.

Потенциальное применение:

  • Для фундаментальных исследований: отслеживание каскада генетической активности (генетической сети), влияющей на интересующий ген.
  • Для медицинских исследований: быстрый поиск регуляторных последовательностей, контролирующих гены болезней, и потенциально новых мишеней для лекарств.

Как работает метод?

  1. Используются готовые библиотеки однонаправляющих РНК (sgRNA) для каждого гена в геноме.
  2. К каждой sgRNA прикрепляется уникальная случайная нуклеотидная последовательность — штрихкод.
  3. Этот штрихкод связан с промотором, который транскрибирует штрихкод только в том случае, если интересующий ген-мишень также "включен".
  4. Все sgRNA с их штрихкодами вносятся в пул клеток одновременно.
  5. Метод глубокого секвенирования (deep sequencing) напрямую измеряет и подсчитывает относительное количество каждого штрихкода в объединённой пробе.
  6. Изменение обилия конкретного штрихкода указывает на то, как "выключение" гена, на который нацелена соответствующая sgRNA, повлияло на экспрессию изучаемого гена-мишени.

Преимущества CiBER-seq:

  • Скорость: один объединённый эксперимент CiBER-seq за день позволяет найти все вышестоящие регуляторы для нескольких генов-мишеней.
  • Масштаб: позволяет одновременно тестировать десятки тысяч CRISPR-воздействий (например, более 200 000 различных sgRNA для человеческих клеток).
  • Точность: прямое измерение изменения экспрессии генов позволяет улавливать тонкие физиологические эффекты.

В первых экспериментах команда протестировала метод на пяти отдельных генах дрожжей, включая гены, вовлечённые в метаболизм, деление клетки и клеточный ответ на стресс. Метод позволяет одновременно изучать до 100 генов, но для удобства исследователи, вероятно, будут ограничиваться четырьмя или пятью.

Подробности техники опубликованы 10 декабря в журнале Science.