CRISPR-метка повышает точность создания модельных клеток из стволовых
Инженеры-биомедики из Университета Дьюка разработали новый метод превращения стволовых клеток в нужный тип клеток, научившись управлять языком генных регуляторных сетей.
Хотя перепрограммирование стволовых клеток — не новая идея, существующие методы часто дают неидеальные результаты. Клетки могут не достигать нужной зрелости in vitro. Например, попытка получить взрослые нейроны для моделирования поздних нейродегенеративных заболеваний может привести к созданию эмбриональных нейронов.
"Клетки могут выглядеть правильно на первый взгляд, но им часто не хватает ключевых свойств", — отметил Джош Блэк, аспирант из лаборатории Чарльза Герсбаха.
Используя CRISPR-редактирование, команда определила, какие транскрипционные факторы (главные регуляторы активности генов) критически важны для создания полноценного нейрона. Исследование, опубликованное 1 декабря в Cell Reports, демонстрирует потенциал метода для получения зрелых взрослых нейронов, но он применим для программирования любого типа клеток.
Метод: от редактирования к активации
Обычно CRISPR/Cas9 используется для «геномного редактирования» — разрезания и изменения последовательности ДНК. Однако для перепрограммирования клеток нужно не редактировать, а включать гены.
Лаборатория Герсбаха использовала деактивированный белок dCas9, который связывается с ДНК, не разрезая её. К нему присоединяются молекулярные домены, способные активировать ген и ремоделировать хроматин.
Масштабный скрининг тысяч факторов
Учёные начали с плюрипотентных стволовых клеток и создали библиотеку из тысяч гидРНК, нацеленных на все гены транскрипционных факторов в геноме человека. Каждая клетка получала только одну гидРНК, активирующую свой конкретный ген-мишень.
Клетки были модифицированы так, чтобы флуоресцировать красным при превращении в нейрон. Чем ярче свечение, тем сильнее продвижение к нейрональной судьбе. Отсортировав самые и наименее красные клетки и секвенировав их гидРНК, исследователи выявили, какие гены способствуют или препятствуют нейрональному превращению.
Проверка функциональности
Анализ экспрессии генов показал, что полученные клетки были более специфичными и зрелыми. Также были обнаружены синергичные пары генов и факторы-антагонисты, подавление которых усиливало нейрональную спецификацию.
Ключевым тестом стала проверка способности передавать электрические сигналы. С помощью patch clamp электрофизиологии Шатаакши Дубе из лаборатории профессора Скотта Содерлинга подтвердила, что инженерные нейроны испускали потенциалы действия, причём клетки с активированной парой определённых транскрипционных факторов были функционально более зрелыми.
"Было удивительно видеть, насколько эти запрограммированные клетки похожи на нормальные нейроны", — сказала Дубе.
Значение и перспективы
- Скорость: Процесс от стволовой клетки до зрелого нейрона занял 7 дней вместо недель или месяцев по стандартным протоколам.
- Моделирование болезней: Метод позволяет создавать более точные модели для изучения болезни Альцгеймера, Паркинсона и шизофрении, которые сложно смоделировать на незрелых клетках.
- Скрининг лекарств: Разные типы клеток по-разному реагируют на препараты.
- Универсальность: Этот же подход скрининга можно применять для улучшения методов получения любых типов клеток, что важно для регенеративной медицины и клеточной терапии. Ранее группа Герсбаха уже использовала CRISPR-активацию для превращения стволовых клеток в клетки-предшественники мышц.
"Ключ — в использовании мощности и масштабируемости CRISPR-нацеливания на ДНК для программирования любой функции в любой тип клетки. Используя уже закодированные в нашем геноме генные сети, мы dramatically улучшаем контроль над клеточной биологией", — заключил Чарльз Герсбах.