Новая платформа для редактирования генома значительно повышает точность CRISPR-систем

Новая система редактирования генома, разработанная исследователями из Массачусетской больницы общего профиля (MGH), существенно снижает риск возникновения нежелательных, внецелевых мутаций. В статье, опубликованной в Nature Biotechnology, сообщается о новой технологии CRISPR на основе РНК-направленных нуклеаз, которая использует две направляющие РНК, значительно уменьшая вероятность разрезания цепей ДНК в несовпадающих участках.

Эта система сочетает простоту использования широко распространённой системы CRISPR/Cas с зависимой от димеризации нуклеазной активностью, обеспечивающей более высокую специфичность действия. Повышенная специфичность будет иметь решающее значение для любого будущего клинического применения этих нуклеаз, а новый класс белков может стать важным вариантом для терапевтического редактирования генома.

Созданные CRISPR-Cas нуклеазы — инструменты редактирования генома, сочетающие короткий сегмент РНК, соответствующий цели в ДНК, с ферментом Cas9, разрезающим ДНК, — активно исследуются с момента их создания в 2012 году. Они проще в использовании, чем более ранние системы ZFN (цинк-пальцевые нуклеазы) и TALEN (нуклеазы на эффекторах, подобных активаторам транскрипции), и успешно индуцировали геномные изменения в нескольких модельных системах на животных и в человеческих клетках. Однако в предыдущей статье в Nature Biotechnology за июнь 2013 года команда сообщила, что CRISPR-Cas нуклеазы могут вызывать дополнительные мутации в человеческих клетках даже на участках, отличающихся от целевой ДНК на целых пять нуклеотидов.

Чтобы решить эту проблему, исследователи разработали новую платформу, в которой функция нацеливания Cas9 была объединена с нуклеазой, полученной из хорошо охарактеризованного фермента FokI. Этот фермент функционирует только тогда, когда две копии молекулы объединяются в пару (димеризация). Это изменение фактически удвоило длину последовательности ДНК, которая должна быть распознана для разрезания новыми CRISPR РНК-направленными нуклеазами FokI (RFN), что значительно повысило точность редактирования генома в человеческих клетках. Важно, что команда также продемонстрировала, что эти новые RFN так же эффективны в модификации целевого участка, как и существующие Cas9 нуклеазы, нацеленные на более короткую последовательность ДНК.

Удвоив длину распознаваемой последовательности ДНК, исследователи создали новый класс инструментов для редактирования генома с существенно улучшенной точностью по сравнению с существующими дикими типами Cas9 нуклеаз и никазами (ферментами, разрезающими одну цепь ДНК). Команда также разработала программное обеспечение, позволяющее пользователям идентифицировать потенциальные сайты-мишени для этих RFN, и включила эту возможность в пакет ZiFiT Targeter, свободно доступный по адресу http://zifit.partners.org.