Новый алгоритм выявляет «ускользающие» клетки в CRISPR-скринингах на уровне одной клетки
Исследователи из Нью-Йоркского университета и Нью-Йоркского центра генома разработали новый вычислительный инструмент для изучения функции и регуляции человеческих генов. Результаты, опубликованные в журнале Nature Genetics, показывают, как интерпретировать эксперименты, сочетающие CRISPR для нарушения работы генов с мультимодальным секвенированием на уровне одной клетки.
Новый подход, названный mixscape, помог выявить новый молекулярный механизм регуляции иммунных контрольных точек (например, белка PD-L1), которые управляют способностью иммунной системы распознавать и уничтожать раковые клетки.
«Наш подход поможет ученым связать гены с конкретными клеточными процессами и молекулярными путями, которые они регулируют», — объясняет старший автор работы Рахул Сатья.
Ученые провели pooled генетический скрининг, «выключая» (нокаутируя) набор генов в модели раковой клеточной линии, чтобы наблюдать влияние каждого нарушения на уровни PD-L1. Они использовали технологию ECCITE-seq, позволяющую получать профили разных типов биомолекул (например, РНК и белка) на уровне одной клетки после воздействия CRISPR «гидовой РНК» на каждый ген. Мультимодальный анализ позволил различать транскрипционный и посттранскрипционный уровни регуляции.
Однако после экспериментов команда столкнулась со значительными вычислительными сложностями. Например, при попытке нокаутировать один и тот же ген в разных клетках наблюдалась высокая вариабельность результатов. До 75% клеток в некоторых случаях «ускользали» от наблюдаемых эффектов после попытки воздействия, создавая значительный шум в анализе.
«Эти трудности заставили нас осознать необходимость новых вычислительных методов для выявления и удаления мешающих источников вариаций в наших данных», — говорит ведущий автор Эфтимия Папалекси.
Для решения проблемы команда разработала статистический подход mixscape, который моделирует каждое воздействие как создающее смесь клеток с разными ответами. Этот метод позволяет идентифицировать и удалять источники шума, фокусируясь на оставшихся важных биологических сигналах.
«Применение mixscape в нашем скрининге усилило нашу способность связывать генетические нарушения с изменениями в транскриптоме и экспрессии белка. Это позволило нам обнаружить, что белок KEAP1 и транскрипционный активатор NRF2 опосредуют уровень экспрессии PD-L1 в клетке», — говорит Сатья.
Хотя исследования проводились на раковых клеточных линиях, гены KEAP1 и NRF2 часто мутируют в образцах рака легких у человека, что предполагает их важную роль в развитии и прогрессировании опухолей.
В дальнейшем исследователи планируют использовать мультимодальные CRISPR-скрининги на уровне одной клетки и mixscape для изучения молекулярной регуляции десятков других путей и клеточных процессов.
Mixscape доступен онлайн через пакет Seurat лаборатории Сатьи, который представляет собой набор инструментов для биомедицинских исследований.