Раскрыт механизм защиты реплицированной ДНК от деградации

Исследователи из Токийского столичного университета и Института молекулярной онкологии FIRC (IFOM) в Италии успешно истощили ключевой для репликации ДНК белок AND-1, используя недавно разработанную систему условной деградации белков. Это дало беспрецедентный доступ к лежащему в основе механизму и позволило установить, что во время репликации ДНК и пролиферации клеток позвоночных AND-1 выполняет две различные функции, опосредованные разными доменами белка.

Белок AND-1/Ctf4 — ключевой игрок в репликации ДНК, встречающийся у широкого спектра живых организмов. Его роль в пролиферации клеток позвоночных экспериментально не была показана.

Чтобы решить этот вопрос, команда под руководством доктора Даны Бранзей (IFOM) и профессора Кодзи Хироты (Токийский столичный университет) объединила клетки DT40 (особенно подходящие для генной инженерии) и систему ауксин-индуцируемого дегрона (AID) для селективного истощения целевого белка. Они создали клеточную линию and-1-aid, в которой модифицированная версия белка AND-1 деградирует за несколько часов после добавления фитогормона ауксина. Это позволило наблюдать острые последствия потери AND-1.

Авторы использовали просвечивающую электронную микроскопию (TEM) для визуализации промежуточных продуктов репликации ДНК. В отсутствие AND-1 они наблюдали вновь синтезированную ДНК с аномально длинной одноцепочечной ДНК в точке ветвления репликационной вилки. Гипотеза состояла в том, что это вызвано нарушением процесса разборки цепи нуклеазой (ферментом, разрезающим ДНК).

Дальнейшее добавление соединения, подавляющего действие специфической нуклеазы MRE11, позволило обратить аномальный фенотип репликационной вилки и восстановить деление клеток. Это явно продемонстрировало ключевую роль AND-1 в предотвращении расщепления зарождающейся ДНК нуклеазой во время репликации. Дополнительный анализ показал, что за предотвращение накопления повреждений цепи отвечает специфическая часть белка — WD40-повторы.

Исследование демонстрирует успешное сочетание передовых методов для условной инактивации специфических белков. Новые клеточные линии были разработаны в течение одного месяца, что открывает перспективы для применения метода к изучению других генов и процессов.