Новый метод изучения химических меток на ДНК после репликации
Исследователи разработали высокочувствительный количественный метод на основе масс-спектрометрии — iDEMS (isolation of DNA by EdU labeling for Mass Spectrometry). Технический отчет опубликован в Nature Cell Biology.
«Новизна нашей работы в том, что мы не использовали широко применяемые в этой области методы секвенирования, а вместо этого применили масс-спектрометрию. Это первый случай, когда такой подход использован для измерения модификаций ДНК на очищенной, реплицированной ДНК», — говорит соавтор работы доктор Стюарт-Морган из лаборатории Грота в Центре исследований белков Novo Nordisk Foundation (CPR) Копенгагенского университета.
Метод стал результатом совместного проекта с лабораторией Хайковой в Институте медицинских наук MRC в Лондоне (LMS).
Модификации ДНК и стабильность клетки
Один из ключевых эпигенетических регуляторов — метилирование ДНК, химическая метка, «выключающая» участки генома. Узор этих меток важен для поддержания стабильности и идентичности клетки.
При репликации ДНК во время деления клетки эпигенетические метки, включая метилирование, «разбавляются». Вновь созданные цепи ДНК должны восстановить уровень и паттерн метилирования, чтобы сохранить контроль над экспрессией генов, стабильность генома и эпигенетическую память.
Многое в этом процессе неизвестно, а потеря метилирования ДНК характерна для активно делящихся клеток, таких как раковые или стареющие клетки.
Восстановление метилирования
С помощью iDEMS исследователи обнаружили, что уровень метилирования ДНК после репликации steadily увеличивается и через 4 часа сравнивается с уровнем на геномной ДНК. Это указывает на медленный, steady процесс. Однако он отстает от скорости деления клеток.
«Со временем у клеток просто не хватает времени, чтобы восстановить метилирование после репликации, и метилирование генома в итоге „разбавляется“. Впервые показана очень четкая кинетика восстановления метилирования. Более того, мы увидели абсолютную количественную оценку уровней метилирования ДНК, что позволило нам отличить вновь установленные метки. Это придало нам уверенности в наших кинетических измерениях», — сообщает доктор Стюарт-Морган.
Вторая химическая метка
Исследователи также использовали iDEMS для изучения второй, гораздо более редкой метки — гидроксиметилирования ДНК.
«Мы обнаружили, что одна цепь ДНК, матричная или „родительская“, всегда имеет больше гидроксиметилирования, чем другая, „дочерняя“ цепь, что подтверждает более ранние данные о том, что эта метка различает цепи ДНК по возрасту», — говорит доктор Стюарт-Морган.
«Однако мы также обнаружили, что в течение клеточного цикла нет момента, когда уровни гидроксиметилирования сравниваются между родительской и дочерней цепями. Это открывает новые вопросы о том, как клетки могут использовать это различие, например, при репарации ДНК».
Потенциал iDEMS
Непосредственно количественно определяя модификации ДНК на реплицированной ДНК, iDEMS раскрывает кинетику метилирования и гидроксиметилирования ДНК после репликации. «iDEMS — это динамичный и информативный инструмент для решения важных вопросов в области поддержания эпигенома и биологии модификаций ДНК», — говорит доктор Стюарт-Морган.
В будущем iDEMS будет полезен для изучения динамики метилирования и гидроксиметилирования в различных клеточных контекстах, включая старение и эволюцию рака. По сравнению с данными секвенирования, масс-спектрометрия дает простой и быстрый результат, поэтому iDEMS может быть полезен там, где важна эффективность, например, в медицинских учреждениях и исследованиях по открытию лекарств.
«Наши результаты подчеркивают, насколько важны новые методы для понимания биологии через более чем одну призму. iDEMS чрезвычайно гибок, так как его можно комбинировать с другими established методами молекулярной биологии для изучения эпигенома. Таким образом, этот метод добавляет важный инструмент в арсенал технологий, исследующих стабильность эпигенома», — заключает доктор Стюарт-Морган.