Новый живой дрожжевой двойной биосенсор для обнаружения вариантов пептидов
Биосенсоры — мощный инструмент для изучения биохимических молекул. В 2017 году исследователи из Колумбийского университета (США) создали живой дрожжевой биосенсор, перепрограммировав сигнальные пути, связанные с феромонами, которые дрожжи используют для спаривания. При обнаружении пептида-феромона G-белковым рецептором (GPCR) запускался каскад реакций, активирующий пигмент ликопин, что приводило к видимому невооруженным глазом изменению цвета.
Однако этой системе не хватало протеазы — фермента, расщепляющего пептиды. Добавление протеазы должно было улучшить возможности биосенсора по обнаружению и различению пептидов.
В новом исследовании, опубликованном в BioDesign Research, группа разработала улучшенную двойную версию живого дрожжевого биосенсора, включив в него коэкспрессируемые дрожжевые протеазы.
Профессор Вирджиния В. Корниш, руководитель исследования, объясняет: «Нашей целью было создать двойной биосенсор. В первой части биосенсор без протеазы обнаруживает присутствие всех вариантов пептида. Во второй части присутствует протеаза. Только один вариант белка будет расщеплен протеазой, так что изменение цвета будет видно только для этого конкретного варианта. Здесь мы попытались разработать доказательство концепции для этой модели».
Исследователи проанализировали дозозависимые кривые пяти грибковых феромоновых GPCR, пептидов и протеаз из Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces octosporus и Schizosaccharomyces japonicus. Наиболее селективные ответы дали первые два вида.
Затем с помощью аланинового сканирования были проанализированы пептиды S. cerevisiae и C. albicans. Были идентифицированы два варианта пептида, которые не могли эффективно расщепляться протеазой: CaPep2A и CaPep2A13A. В то же время их «сестринские» пептиды — CaPep и CaPep13A, соответственно — расщеплялись эффективно. Изменения цвета можно было наблюдать невооруженным глазом.
Эти компоненты были объединены в живой дрожжевой клетке для создания двухфазного биосенсора. Эксперименты по доказательству концепции показали, что биосенсор может не только обнаруживать присутствие пар CaPep/CaPep2A и CaPep13A/CaPep2A13A, но и различать их. Таким образом, добавление протеазы значительно расширило возможности оригинального биосенсора.
По словам профессора Корниш, эта работа — первый фундаментальный шаг к созданию биосенсора, способного различать широкий спектр пептидов. «Синтетическая биология — это пошаговый процесс. Разработанная в текущем исследовании структура может быть улучшена с помощью компьютерного моделирования и направленной эволюции. Это расширит возможности биосенсора по обнаружению».
«Мы могли бы использовать эти биосенсоры, содержащие протеазы, в диагностических инструментах у постели больного, для тестирования лекарств и даже для разработки масштабируемого языка коммуникации. Возможности безграничны», — заключает она.
В целом, это исследование дает ключевое представление о манипулировании компонентами дрожжевого спаривания для создания инструментов синтетической биологии.