Структурная основа двухметалл-ионного катализа расщепления ДНК в Cas-белках

Ключевой вопрос: Как RuvC-домен в Cas-белках (включая Cas9 и Cas12a) расщепляет ДНК? Для ответа необходимо было получить структуры Cas-комплексов в каталитически активном состоянии, с двумя металл-ионами и субстратом одноцепочечной ДНК (ssDNA) в кармане RuvC-домена.

Объект исследования: Cas12i2 — белок системы CRISPR-Cas типа V-I класса 2, открытый в 2018 году. Он легче Cas12a и Cas9 по молекулярной массе и рассматривается как перспективный инструмент для редактирования генов.

Метод и основные результаты: Учёные из Института биофизики и Университета науки и технологий Китая (CAS) опубликовали в Nature Communications кристаллические структуры комплексов Cas12i2-crRNA и Cas12i2-crRNA-ДНК. Исследование раскрыло:

1. Механизм активации: Конформационное изменение домена Helical-II активирует RuvC-каталитический карман.
2. Каталитическое состояние: Впервые удалось зафиксировать активное состояние RuvC-домена с двумя металл-ионами и субстратом ssDNA в каталитическом кармане. Это раскрыло ключевую роль металл-ионов в расщеплении ДНК.
3. Условия расщепления: Дуплекс crRNA:ДНК длиной 13 нуклеотидов (13-nt) и более способен инициировать расщепление. Активность по расщеплению двуцепочечной ДНК (dsDNA) зависит от процессинга пре-crRNA.
4. Особенности Cas12i2: Расщепление ssDNA этим белком не зависит от PAM (последовательности, прилегающей к Protospacer). Для активации RuvC-кармана необходимо образование гибрида crRNA:целевая ДНК, при этом спаривание оснований в "seed region" (затравочной области) не является обязательным.

Значение: Работа даёт важное понимание механизма расщепления ДНК Cas-белками, содержащими RuvC-домен, и открывает перспективы для разработки более эффективных инструментов редактирования генома и детекции нуклеиновых кислот.