Флуоресцентные метки позволяют наблюдать за сигнальными белками факторов роста в живых клетках в реальном времени

Синтетические биологи из Университета Райса и Принстонского университета представили технологию "живых репортеров", которая позволяет наблюдать за работой сетей сигнальных белков в живых клетках с гораздо большей точностью, чем существующие методы. Этот первый в своём роде инструмент может показать, например, как быстро реагируют сигнальные сети и как их ответы различаются от клетки к клетке во времени и пространстве.

Исследователи создали инструмент, используя малозаметные белки, которые "прикрепляются" к важному сигнальному механизму, используемому человеческими клетками для регуляции роста, дифференцировки, миграции, воспаления и других процессов.

В исследовании, недавно опубликованном в журнале с открытым доступом eLife, команда продемонстрировала свой модульный подход для мечения рецепторных тирозинкиназ (RTK) репортерными белками, которые активируют зелёный флуоресцентный белок всякий раз, когда их партнёры RTK фосфорилируются.

Киназы — это ферменты, которые могут изменять поведение других белков, присоединяя или отсоединяя фосфатные группы (процесс, называемый фосфорилированием). RTK — это специализированные киназы, которые сами фосфорилируются, когда обнаруживают входящие сигналы или стимулы вне клетки, а затем регулируют жизненно важные функции клетки.

Команда показала, что систему "живых репортеров" можно использовать с микроскопом для создания видеозаписи активности сигнальной сети в живых клетках. То, где клетки светятся и насколько ярко, показывает местоположение и интенсивность ответа сигнальной сети.

"Большую часть времени, когда вы изучаете процессы внутри клеток, такие как сигнальные сети или генетические сети, вам приходится разрушать клетки, чтобы изучить их содержимое. Любая возможность создать систему, в которой клетки остаются живыми, и можно наблюдать, как сигнальная сеть работает в реальном времени внутри клетки, — это большое преимущество".

Исследователи назвали репортеры pYtags, ссылаясь на биохимическую номенклатуру, где тирозин обозначается как "Y", а фосфорилированный тирозин — как "pY".

pYtags были разработаны в сотрудничестве с исследовательскими группами из Принстона. Исследование показало, что система может записывать активность RTK, называемых рецепторами факторов роста, в человеческих фибробластах.

"Мы берём инженерный белок, который является частью другой системы — на самом деле, частью иммунной сигнализации — и помещаем его в этот новый контекст, то есть в фибробласты. Мы считаем, что он, вероятно, не взаимодействует ни с чем другим в клетке, потому что он из совершенно другого типа клеток. Так что он просто "висит" на конце рецептора фактора роста".

Репортер pYtag сконструирован так, чтобы коактивироваться со своим партнёром RTK и запускать пропорциональное количество флуоресценции. Таким образом, чем сильнее ответ RTK, тем ярче клетка светится при наблюдении под микроскопом.

"Он может получать этот сигнал фосфорилирования от рецептора фактора роста. Поэтому, когда рецептор активируется, зелёный флуоресцентный белок связывается с чем-то рядом с мембраной, и вы получаете то, что выглядит как зелёное кольцо вокруг внешней стороны клетки. Это показывает вам в реальном времени, когда клетки обнаруживают фактор роста и как быстро включается путь".

pYtags можно использовать для мониторинга многих типов тирозинкиназных рецепторов.

"Мы показываем в статье, что этот репортер можно присоединить к нескольким различным типам рецепторов факторов роста, и он может служить репортером для всех них. Это окно в динамику клеточной сигнализации, которого у нас раньше действительно не было".