Модифицированный коралловый пигмент помогает учёным наблюдать за движением белков
Учёные из Великобритании (Саутгемптон) и Германии (Ульм, Карлсруэ) показали, что вариант флуоресцентного белка (FP), изначально выделенного из рифового коралла, обладает отличными свойствами в качестве маркерного белка для микроскопии сверхвысокого разрешения в живых клетках. Результаты опубликованы онлайн в Nature Methods и выйдут в печатном выпуске журнала в августе.
Фотоактивируемые FP (PA-FP) можно «включать» светом определённой длины волны, после чего они начинают светиться характерным цветом.
Ранее команда описала белок EosFP из коралла Lobophyllia. Методами генной инженерии был создан вариант IrisFP с двойной фотоактивацией. В одном режиме он необратимо «фотоконвертируется» из зелёной в красную форму под фиолетовым светом. В другом режиме эти две светящиеся формы можно многократно включать и выключать светом разных длин волн («фотопереключение»).
Для экспериментов PA-FP генетически сшивают с изучаемыми белками и экспрессируют в живых клетках. Подсвечивая лазером небольшие области клетки, можно визуализировать динамические процессы.
В природной форме четыре молекулы IrisFP объединяются в тетрамер, что создаёт проблемы для применения. Чтобы решить это, исследователи модифицировали белок, введя четыре мутации. Это стабилизировало отдельные молекулы (мономеры) и снизило их склонность к образованию тетрамеров.
«Мономерный вариант, mIrisFP, сохраняет двойную фотоактивацию и обладает отличными свойствами как генетически кодируемый флуоресцентный маркер», — пояснил доктор Йорг Виденманн из Университета Саутгемптона.
Для проверки полезности mIrisFP его генетически сшили с несколькими белками в культивируемых клетках, включая факторы транскрипции и белки цитоскелета. Во всех случаях химерные белки функционировали нормально.
Дальнейшие эксперименты показали, что с помощью mIrisFP можно изучать динамические процессы в живых клетках с пространственным разрешением, превышающим пределы обычной световой микроскопии. В частности, исследователи успешно сочетали pulse-chase эксперименты с микроскопией локализации фотоактивации (PALM), чтобы отслеживать движение меченых белков с очень высоким разрешением.
«Двойная фотоактивация и мономерная природа mIrisFP должны позволить клеточным биологам проводить более широкий спектр экспериментов по сравнению с использованием только обычных PA-FP», — сказал Виденманн.