Исследование раскрывает молекулярные детали процесса репарации ДНК у человека
Учёные раскрыли структурные механизмы одного из основных путей репарации ДНК в человеческих клетках.
Исследование, опубликованное в eLife как Reviewed Preprint, описывается редакторами как знаковая работа, предоставляющая убедительные доказательства того, как ключевой игрок в репарации ДНК — филамент RAD51 — способствует обмену цепями между молекулами ДНК, содержащими гомологичные (идентичные или схожие) последовательности.
Гомологичная рекомбинация (HR) — один из ключевых путей репарации ДНК. Она необходима для восстановления двуцепочечных разрывов ДНК и для кроссинговера во время полового размножения. Клетки с дефектами HR более склонны к раку, а их HR-машинерию можно использовать как мишень для уничтожения раковых клеток (подход «синтетической летальности»).
Уникальная особенность HR — высокая точность репарации. В эукариотических клетках HR осуществляется ферментом RAD51, который связывается с одноцепочечной ДНК в месте повреждения, формируя нуклеопротеиновый филамент. Этот филамент ищет комплементарную последовательность, «вторгаясь» в сестринскую хроматиду или гомологичную хромосому. При нахождении правильной последовательности формируется стабильная трёхцепочечная структура — D-петля (displacement loop), и происходит обмен цепями. Однако механистическое понимание этого последнего шага оставалось ограниченным.
«Мы получили структуру методом крио-электронной микроскопии, которая фиксирует состояние человеческого Rad51, прочно связанного с повреждённой ДНК», — говорит соавтор Луай Джудэ. «Структура впервые раскрывает механизм, лежащий в основе процесса обмена цепями во время репарации ДНК посредством гомологичной рекомбинации».
Команда подготовила в лаборатории образец D-петли человеческого RAD51 для визуализации методом крио-ЭМ (cryoEM). Из тысяч снимков было построено 3D-структура из более чем 100 000 отдельных частиц D-петли, показавшая положение каждого компонента HR во время обмена цепями.
«Мы обнаружили, что для поиска комплементарной последовательности RAD51 сначала расплетает двойную спираль ДНК-донора, вставляя физические разделители, чтобы развести цепи», — объясняет старший автор Лука Пеллегрини.
Этими разделителями являются L2-петли. Каждое вставление обнажает основания трёх нуклеотидов ДНК, которые становятся доступными для спаривания с вторгающейся цепью и проверки на гомологию.
«Интересное наблюдение: на одном конце структуры D-петли L2-петли RAD51 вызывают сильное изменение, раскрывая ДНК-донор, а на другом конце их роль гораздо более ограничена. Это указывает на предпочтительную ориентацию в процессе формирования D-петли и показывает, что L2-петли обладают внутренней гибкостью», — отмечает Пеллегрини.
Другие неожиданные открытия:
- Вторгающаяся цепь связывается со всей комплементарной последовательностью ДНК-донора, кроме одной доступной пары оснований, которая остаётся несформированной. Авторы предполагают, что расплетание ДНК во время HR увеличивает расстояние между нуклеотидами, не позволяя им спариться.
- На другом конце комплементарной последовательности обнаружено одно несовпадение нуклеотидов между вторгающейся и донорской цепями, что показывает, что формирование D-петли иногда может допускать различия в последовательности.
- Структура крио-ЭМ показала, что обмениваемая цепь захватывается в канале внутри комплекса RAD51, что облегчает её удаление. Удалось идентифицировать точные компоненты RAD51, создающие этот канал.
«Вместе эти находки формируют основу модели HR, в которой связывание RAD51 направляет повреждённую ДНК в положение, где физические разделители (L2-петли) могут развести цепи, захватить обмениваемую цепь и облегчить обмен», — объясняет соавтор Роберт Эпплби.
«Наша структура D-петли RAD51 даёт фундаментальное понимание биохимической реакции эукариотической гомологичной рекомбинации», — говорит Пеллегрини. — Мы полагаем, эти insights будут полезны для изучающих процессы репарации ДНК в здоровье и болезни, а также для разработки терапий, способных либо восстанавливать, либо блокировать эти механизмы при таких заболеваниях, как рак».