Исследователи разработали новые редакторы цитозиновых оснований с высокой специфичностью и точностью

Редакторы оснований (base editors), позволяющие вносить высокоэффективные целевые точковые мутации в геномную ДНК без разрыва обеих цепей, имеют большой потенциал для генной терапии человека и улучшения признаков у сельскохозяйственных растений.

Группа Гао Цайся из Института генетики и биологии развития Китайской академии наук занимается разработкой технологий редактирования оснований для растений. Исследователи показали, что редакторы цитозиновых оснований (cytosine base editors, CBEs) вызывают нежелательные внецелевые мутации по всему геному риса, чтобы стимулировать мировое сообщество по редактированию генома к их исправлению.

Недавно команда Гао создала два новых CBE на основе усеченной цитидиндезаминазы человека APOBEC3 (A3Bctd) и разработала высокопроизводительный метод для оценки sgRNA-независимых дезаминирующих изменений в растительных CBE.

Ортогональный R-петлевой анализ

Сначала они разработали быстрый, высокопроизводительный и недорогой метод оценки CBE в растениях (nSaCas9-опосредованный ортогональный R-петлевой анализ). В этом методе ортогональная CRISPR-система nSaCas9 использовалась для создания участков одноцепочечной ДНК (ssDNA) в растительных клетках, которые служили мишенями для sgRNA-независимых дезаминирующих изменений. Для оценки метода его результаты сравнили с данными полногеномного секвенирования (whole-genome sequencing, WGS). Согласованные результаты показали, что nSaCas9-опосредованный ортогональный R-петлевой анализ обеспечивает логичный, быстрый и высокопроизводительный способ оценки sgRNA-независимой внецелевой активности CBE.

Создание и отбор новых вариантов CBE

Затем с помощью рационального дизайна они создали 16 вариантов дезаминазы A3Bctd и оценили их эффективность на целевых участках и sgRNA-независимую внецелевую активность. Эти варианты A3Bctd-BE3 протестировали с помощью R-петлевого анализа и отобрали семь мутаций, связанных с эффективной активностью редактирования на цели и сниженной внецелевой активностью. После этого эти мутации скомбинировали и получили девять новых вариантов A3Bctd-BE3 с двойными или тройными аминокислотными заменами.

Таким образом были получены два новых варианта CBE: A3Bctd-VHM-BE3 и A3Bctd-KKR-BE3. Они продемонстрировали эффективную активность на цели и значительно сниженную sgRNA-независимую внецелевую активность.

Кроме того, эти новые CBE работали более точно на своих целевых сайтах, производя в основном одно- и двукратные замены цитозина (C). Высокая специфичность A3Bctd-VHM-BE3 и A3Bctd-KKR-BE3 также была подтверждена методом WGS.

Научная статья под названием "Rationally designed APOBEC3B cytosine base editors with improved specificity" была опубликована онлайн в журнале Molecular Cell 27 июля.

Исследование в основном поддержано Национальной программой трансгенных технологий, Стратегической программой приоритетных исследований Китайской академии наук и Национальным фондом естественных наук Китая.