Разработан новый «охлаждающий» метод исследования сворачивания молекул
Ученые из Исследовательского института Скриппса (TSRI) и Калифорнийского университета в Сан-Диего (UC San Diego) создали мощную систему для изучения того, как белки и другие биомолекулы обретают и теряют свою естественную трехмерную структуру.
Новая система позволяет заставить молекулы в образце разворачиваться и снова сворачиваться, резко повышая, а затем понижая температуру. Этот процесс происходит так быстро, что можно отслеживать даже самые быстрые события молекулярного фолдинга.
«Один из способов изучения этих структур — заставить их разворачиваться или сворачиваться с помощью тепла и наблюдать за кинетикой этих процессов. Новая система позволяет делать это, преодолевая ключевые ограничения предыдущих методов», — пояснил доцент TSRI Ашок А. Дениз.
Устройство можно применять для изучения не только нормальных биомолекул, но и многих аномальных, склонных к неправильному сворачиванию, которые связаны с болезнями человека. Результаты работы лабораторий Дениза и его коллеги-биофизика Алекса Гройсмана из UC San Diego опубликованы на этой неделе в Nature Communications.
Слишком маленькие и быстрые
Изучение фолдинга белков, ДНК и других биомолекул — одна из самых сложных задач в биологии. Эти крошечные молекулы, меньше длины волны видимого света, могут сворачиваться или разворачиваться за интервалы в несколько миллионных долей секунды (микросекунды).
Хотя за последнее десятилетие появились мощные методы отслеживания быстрых молекулярных движений, техники воздействия на свернутые молекулы с помощью резких скачков температуры отставали. «Величина скачков температуры была ограничена примерно 15 градусами Цельсия, и у нас не было способа быстро охлаждать образцы до комнатной температуры», — отметил Дениз.
В новой работе лаборатории создали микрофлюидное устройство, преодолевающее эти ограничения. Оно представляет собой небольшой блок из силикона с крошечными каналами для потока раствора с биомолекулами. Наблюдательный канал глубиной менее миллионной доли метра выстлан сапфиром для быстрого отвода тепла и содержит тонкое золотое покрытие, эффективно поглощающее энергию инфракрасного лазерного луча и преобразующее ее в тепло.
Благодаря малому объему нагрева и энергопоглощающему золотому покрытию лазер может нагревать образец очень быстро — скачок температуры более чем на 50 °C происходит менее чем за микросекунду. Сапфировая подложка, в свою очередь, позволяет образцу охладиться на несколько десятков градусов также примерно за микросекунду после выключения лазера.
Новые возможности
В качестве простого доказательства эффективности устройства исследователи использовали его для нагрева и охлаждения раствора с короткой цепью ДНК, которая естественным образом образует шпилечную петлю. Такие структуры играют ключевую роль в клеточной репликации и других важных биологических процессах.
Эксперимент с применением флуоресцентных методов для детекции состояния ДНК показал, что шпилечная структура может формироваться всего за несколько микросекунд. «Мы не смогли бы наблюдать такое быстрое сворачивание с предыдущими системами скачка температуры, для охлаждения в которых обычно требовались тысячи микросекунд», — сказал Прия Р. Банерджи, научный сотрудник лаборатории Дениза и первый автор статьи вместе с Марком Е. Полинковским из лаборатории Гройсмана и Янном Гамбеном, также работавшим в лаборатории Дениза.
Кроме того, ученые изучили более крупную ДНК-шпильку, что подтвердило ранее предсказанное влияние хлорида натрия (обычной соли) на кинетику сворачивания и разворачивания шпилек разного размера.
В последнем эксперименте команда смогла исследовать, как молекулярная система ведет себя как фильтр низких частот, аналогичный электронным или клеточным схемам. Возможность быстро включать и выключать лазерный нагрев в сочетании с быстрым нагревом и охлаждением позволяет по-новому изучать энергетические ландшафты молекулярного фолдинга. Теперь можно подвергать раствор молекул непрерывной серии циклов нагрева и охлаждения, произвольно меняя частоту и диапазон температур этих колебаний и наблюдая за изменениями в динамике разворачивания/сворачивания.
«Мы ожидаем, что этот тип экспериментов позволит обнаружить более сложные или скрытые особенности структурных ландшафтов биомолекул, которые ранее не наблюдались», — сказал Дениз.
Теперь ученые планируют использовать свою систему для изучения динамики фолдинга других молекул, включая белки, склонные к неправильному сворачиванию и вызывающие такие болезни, как Альцгеймер, Паркинсон и Хантингтон.