Первый взгляд на работу органелл внутри живых клеток
Исследователи из Медицинского института Говарда Хьюза и Национального института детского здоровья и развития человека смогли впервые наблюдать внутреннюю работу живых клеток благодаря новой методике микроскопии, разработанной нобелевским лауреатом Эриком Бетцигом при участии инженеров из Университета Дрекселя. Метод использует световые решётки для активации флуоресцентных меток на каждом типе органелл, что позволяет получать 3D-видео, дающее исследователям наилучшее представление о функционировании клеток. Это позволит лучше понять, как клетки реагируют на стрессовые факторы окружающей среды и на лекарственные препараты.
В статье, опубликованной в Nature, команда описывает методологию использования решётчатого светового листа Бетцига в сочетании с технологией отслеживания изображений, разработанной в Лаборатории анализа вычислительных последовательностей изображений Дрекселя под руководством Эндрю Коэна, PhD. Это позволяет создавать 3D-видео с интервальной съёмкой движения органелл и получать количественные данные об их взаимодействиях.
«Сообщество клеточных биологов много лет признавало, что цитоплазма заполнена множеством различных типов органелл, и область исследований всё больше осознаёт, насколько значим кросс-ток между этими органеллами в форме тесных контактов», — сказала Дженнифер Липпинкотт-Шварц, PhD, из кампуса Janelia Research Campus HHMI и старший автор исследования. «Когда две органеллы сближаются, они могут передавать небольшие молекулы, такие как липиды и кальций, и общаться друг с другом посредством этой передачи. Но до сих пор никто не мог наблюдать весь набор этих взаимодействий в любой конкретный момент времени. Эта технология предоставляет способ сделать это».
Технология Бетцига использует слои световых решёток, взаимодействующих с клетками, помеченными флуоресцентными белками, для построения 3D-микроскопического изображения. В Janelia Research Campus Бетциг и Липпинкотт-Шварц усовершенствовали эту технологию, чтобы получить детальное изображение внутри клетки, пометив каждый тип органелл своим цветом.
Основной вызов заключался в анализе этих данных, который требовал одновременного отслеживания шести различных объектов в 3D. Программная система, разработанная группой Энди Коэна, позволила взглянуть на это более количественно, чем это было бы возможно с помощью обычных инструментов.
Лаборатория Коэна разработала инструмент под названием LEVER 3-D в 2015 году для изучения 3D-изображений нервных стволовых клеток. Он применяет усовершенствованный алгоритм сегментации изображений, который может определять границы клеток и отслеживать их движения. До появления этой технологии обработка микроскопических изображений и видеозаписей с интервальной съёмкой занимала огромное количество времени.
Этот процесс становится ещё сложнее при отслеживании нескольких объектов в трёх измерениях. Группа Липпинкотт-Шварц использовала набор компьютерных программ для фильтрации всего спектра света, излучаемого органеллами, чтобы сфокусировать 3D-изображения и видео. Процесс, называемый «линейным разделением», потребовал более 32 ядер рабочей станции для обработки 7 миллиардов наборов шестицветных изображений, пиксель за пикселем.
Обычно для изучения использовалось дорогое коммерческое программное обеспечение для сборки 3D-объёма. Но эти программы были дорогими, трудоёмкими в использовании и не способны к сложному анализу для отслеживания движущихся объектов с целью получения количественных измерений их поведения и взаимодействий.
Алгоритм Коэна автоматизирует весь процесс, что экономит время исследователей и позволяет задавать — и отвечать на — больше вопросов о том, что делают клетки. Он дополнительно проверил данные, сотрудничая с коллегой из Дрекселя Ури Хершбергом, PhD, сравнив их с 2D-изображениями клеток.
Используя новую технологию для одновременного наблюдения за шестью наборами органелл, команды Липпинкотт-Шварц в Janelia и Национальных институтах здоровья делают новые интересные наблюдения. Они изучают, как органеллы распределяются внутри клетки, как часто и где они взаимодействуют друг с другом, а также когда и как быстро они движутся в различные периоды жизненного цикла клетки.
«Один очень интересный результат заключается в том, что мы обнаружили, что самая большая органелла в клетке, эндоплазматический ретикулум (ЭР), в любой конкретный момент времени занимает около 25% объёма цитоплазмы, исключая ядро. Но если отслеживать, как он рассеивается по цитоплазме в течение короткого периода времени, например, 15 минут, то видно, что за этот период он исследует 95% всей цитоплазмы», — сказала Липпинкотт-Шварц.
Наблюдение за поведением субклеточных структур — это лишь первое применение этой технологии. Теперь, когда доказано, что она генерирует полезные данные, команда продолжит изучение того, что происходит внутри клетки при воздействии лекарств и других распространённых стрессов. Исследователи предполагают, что её можно использовать для изучения гораздо большего, чем шесть типов микроскопических объектов. Это может помочь глубже проникнуть в строительные блоки жизни — во взаимодействия частиц РНК и других белков, которые играют роль в функционировании клетки и поведении больных клеток.