Учёные определили пространственную структуру и механизмы работы нового инструмента редактирования генов — прайм-редактора
Совместное исследование под руководством Ютаро Шуто, Рёи Накагавы и Осаму Нурэки из Токийского университета определило пространственную структуру различных стадий работы нового инструмента редактирования генов — «прайм-редактора». Функциональный анализ на основе этих структур также показал, как прайм-редактор осуществляет обратную транскрипцию (синтез ДНК из РНК), не «разрезая» обе цепи двойной спирали ДНК.
Выяснение этих молекулярных механизмов вносит значительный вклад в создание инструментов редактирования генов, достаточно точных для генной терапии. Результаты опубликованы в журнале Nature.
Прайм-редактирующая система — это молекулярный комплекс из двух компонентов:
- Прайм-редактор, который объединяет белок SpCas9 (используемый в оригинальной технологии CRISPR-Cas) и обратную транскриптазу — фермент, синтезирующий ДНК на матрице РНК.
- Направляющая РНК для прайм-редактирования (pegRNA), которая идентифицирует целевой участок ДНК и кодирует желаемую правку.
Этот комплекс работает как «текстовый процессор», точно заменяя геномную информацию и уже успешно применялся в живых клетках растений, рыбок данио и мышей. Однако детали того, как комплекс выполняет каждый шаг редактирования, оставались неясными из-за отсутствия данных о его пространственной структуре.
Используя криогенную электронную микроскопию, исследователи преодолели проблему нестабильности комплекса в экспериментальных условиях и впервые определили его трёхмерную структуру в нескольких состояниях во время обратной транскрипции на целевой ДНК.
Ключевые открытия:
- Обратная транскриптаза связывается с гибридным комплексом РНК–ДНК в области белка Cas9, ответственной за разрезание одной цепи двойной спирали.
- В процессе обратной транскрипции обратная транскриптаза сохраняет своё положение относительно Cas9.
- Структурный и биохимический анализ показал, что обратная транскриптаза может приводить к дополнительным, нежелательным вставкам нуклеотидов.
Полученные данные открывают новые пути для фундаментальных и прикладных исследований. Стратегия определения структуры, использованная в этой работе, применима и к другим прайм-редакторам на основе иных вариантов Cas9 и обратной транскриптазы. Эта структурная информация будет использована для разработки улучшенных версий прайм-редакторов.