Ученые создали новый инструмент для записи активности протеинкиназ в живых клетках
Исследователи из Института медицинских исследований Макса Планка в Гейдельберге разработали новый молекулярный инструмент Kinprola, который позволяет отслеживать активность протеинкиназ в пространстве и времени. Это открывает возможность изучать связь между активностью киназ и клеточными фенотипами в гетерогенных популяциях клеток и in vivo.
Принцип работы Kinprola
Инструмент основан на механизме, который активируется при воссоединении двух разделенных фрагментов само-мечащегося белка HaloTag.
- Запись происходит, когда присутствуют и флуоресцентный субстрат HaloTag, и специфическая киназная активность.
- Интенсивность мечения контролируется активностью киназы.
- Время записи определяется наличием флуоресцентного субстрата.
Ученые создали рекордеры для четырех протеинкиназ, основное внимание в исследовании (Nature Chemical Biology) уделено протеинкиназе A (PKA).
Преодоление ограничений оптической визуализации
«Мы хотели найти способ записывать активность киназ масштабируемо и с высоким разрешением, без ограничений оптической визуализации. При микроскопии наблюдения обычно ограничены визуализацией в реальном времени относительно небольшого числа клеток и плохо применимы к глубоким тканям», — поясняет Дэ-эн Сунь, руководившая проектом вместе с Каем Йонссоном.
Ключевая инновация: преобразование временной активности в стабильный сигнал
Kinprola использует молекулярный переключатель, зависящий от фосфорилирования — процесса, катализируемого киназами.
- При активации киназы запись инициируется внесением флуоресцентного субстрата, что позволяет пометить активированные белки Kinprola.
- Запись прекращается удалением субстрата.
- Меченая популяция Kinprola остается стабильной с течением времени, в то время как остальной пул белка Kinprola остается немеченым.
Этот подход позволяет разделить процессы записи и анализа, используя различные методы визуализации и проточную цитометрию. Он преобразует транзиентную активность киназы в стабильный флуоресцентный сигнал и отличается высокой универсальностью и масштабируемостью.
Kinprola работает для нескольких киназ и функционирует in vivo. Например, в мозге мышей он может записывать активацию PKA, вызванную инъекцией препарата.