Ученые предлагают «правила» эффективности для улучшения использования новой технологии редактирования генов

Ученые из Johns Hopkins разработали оптимизированный метод и сопутствующие «правила» эффективности для введения новых последовательностей ДНК в клетки после использования инструмента для разрезания генов CRISPR. Ученые утверждают, что метод, основанный на тестах с эмбрионами мышей и тысячами человеческих клеток, может улучшить воспроизводимость и эффективность редактирования генома.

Новый метод и его разработка описаны в онлайн-публикации 28 ноября в Proceedings of the National Academy of Sciences.

CRISPR — это инструмент, который помогает модифицировать геном, предсказывать результат определенных признаков и изучать их, но сам инструмент лишь создает разрывы в геноме. Он не контролирует, как новая последовательность ДНК встраивается в геном.

Ученые поставили задачу изучить, как клетки репарируют разрывы, индуцированные CRISPR, с целью использовать естественный процесс репарации ДНК клетки для введения новых последовательностей. Они с удивлением обнаружили, что клетки охотно копируют последовательности из чужеродной ДНК для репарации разрывов, при условии что чужеродные ДНК являются линейными. Изучив, как фрагменты чужеродной ДНК копируются во время репарации, они сформулировали простые правила для максимально эффективного редактирования генома.

Ключевые выводы исследования:

• Линейная ДНК эффективнее: Линейные фрагменты ДНК работают в качестве донорской ДНК в 2–5 раз эффективнее, чем кольцевые ДНК (плазмиды) в человеческих клетках. Линейную ДНК легко приготовить в лаборатории с помощью ПЦР (PCR).
• Оптимальная длина «плеч гомологии»: «Золотая середина» для длины «плеч гомологии» (участков, помогающих донорской ДНК встроиться) составляет около 35 нуклеотидов — значительно короче, чем обычно используют ученые.
  • Плечи длиной 33–38 нуклеотидов были столь же успешны, как и плечи длиной 518 нуклеотидов, обеспечивая 10–20% успешных редактирований в оптимальных условиях.
  • При длине плеч 15–16 нуклеотидов успешность вставки падала вдвое. Результаты воспроизведены для трех разных локусов в человеческом геноме.
• Длина вставляемой последовательности: Новая вставляемая последовательность (без учета «плеч гомологии») может достигать длины 1000 нуклеотидов.
  • Успешность вставки для последовательностей длиной 57, 714 и 993 нуклеотида составила 45.4%, 23.5% и 17.9% соответственно.
  • Для последовательностей длиннее 1000 нуклеотидов (1122 и 2229) успешность была крайне низкой (~0.5%). Клетки «забиваются» таким большим количеством ДНК.
• Расположение вставки: Успешность редактирования достигает пика, когда новая последовательность расположена в пределах 30 нуклеотидов от сайта разреза CRISPR. За пределами 30 нуклеотидов вставка не работает. Эти параметры подходят для большинства экспериментов, где редактируют лишь 2–3 нуклеотида рядом с сайтом разреза.

Исследователи также протестировали подход на эмбрионах мышей. Используя ПЦР-фрагмент с «плечами гомологии» в 36 нуклеотидов, они успешно встроили последовательность длиной 739 нуклеотидов, кодирующую флуоресцентный белок, в 27 из 87 эмбрионов (31%).

Исследовательская группа уже применяет эти правила для изучения ДНК у нематоды Cenorhabditis elegans и проверяет, применимы ли они к другим типам человеческих клеток. Перед широким внедрением правила необходимо протестировать на большем количестве типов клеток человека и других организмов.