Учёные раскрыли ключевой механизм регуляции рекомбинации ДНК

Мейотическая рекомбинация создаёт генетическое разнообразие и обеспечивает правильное расхождение родительских хромосом. Этот процесс требует, чтобы комплекс рекомбиназ, полимеризованный на одноцепочечной (ss) ДНК (нуклеопротеидная нить), осуществил поиск гомологии и обмен цепями между гомологичными ДНК.

В мейозе Saccharomyces cerevisiae запрограммированные двуцепочечные разрывы ДНК (DSBs) создаются Spo11, что приводит к образованию 3'-одноцепочечных хвостов. После образования эти одноцепочечные участки быстро связываются обильным белком с высоким сродством к ssДНК — Replication protein A (RPA), чтобы защитить их от нуклеолитической деградации или образования высокоорганизованных структур.

Субстраты ssДНК, покрытые RPA, отличаются от "голой" ssДНК из-за высокого сродства RPA. Поэтому для связывания рекомбиназ на RPA-покрытой ssДНК необходим комплекс-медиатор рекомбинации Mei5-Sae3. Однако механистическая роль Mei5-Sae3 в опосредовании активности рекомбиназы Dmc1 оставалась неясной.

Чтобы исследовать, как Mei5-Sae3 стимулирует Dmc1 вытеснять RPA и формировать нуклеопротеидные нити, исследовательская группа из NTU chemistry, NTU IBS и Университета Осаки использовала биохимические методы очистки белков, а также методы одно-молекулярного FRET и Colocalization Single-Molecule Spectroscopy (CoSMoS). Это позволило зафиксировать в реальном времени связывание Dmc1 и диссоциацию RPA на индивидуальных молекулах ДНК с исключительным временным разрешением.

Результаты опубликованы в журнале Nucleic Acids Research.

В отличие от традиционных биологических подходов, которые в основном изучают конечные равновесные продукты ансамблевых реакций, одно-молекулярные методы могут выявить вклад отдельных биохимических шагов от индивидуальных молекул, обнаруживая переходные промежуточные состояния, которые дают понимание прогресса реакции.

Результаты показали, что Mei5-Sae3 стабилизирует зародышевые кластеры Dmc1 из 2-3 молекул на "голой" ДНК, преимущественно снижая скорость диссоциации Dmc1. Mei5-Sae3 также стимулировал сборку Dmc1 на ДНК, покрытой RPA.

С помощью RPA, меченной GFP, было обнаружено сосуществование промежуточного состояния с Dmc1 и RPA на ssДНК до диссоциации RPA. Более того, эффективность вытеснения RPA зависела от концентрации Dmc1, и эта зависимость положительно коррелировала со стабильностью кластеров Dmc1 на короткой ssДНК.

Эти данные предполагают молекулярную модель, согласно которой Mei5-Sae3 опосредует связывание Dmc1 на RPA-покрытой ssДНК, стабилизируя зародышевые кластеры Dmc1, тем самым влияя на динамику RPA на ДНК и способствуя её диссоциации.

Исследование впервые представляет детальную молекулярную модель для этого уникального белка-медиатора Mei5-Sae3, объясняя, как взаимодействие медиатора с рекомбиназой может стимулировать сборку рекомбиназы на RPA-покрытой ssДНК.