Улучшение измерений на молекулярном уровне с помощью «самовосстанавливающихся» флуорофоров
Ученые из Детской исследовательской больницы Сент-Джуд сообщили о способе улучшить измерения расстояний на молекулярном уровне с помощью метода одно-молекулярного флуоресцентного резонансного переноса энергии (smFRET). Результаты опубликованы в Nature Methods.
Проблема «темных состояний»
Метод smFRET измеряет расстояния между двумя точками биомолекулы (порядка миллиардной доли дюйма) с помощью флуоресцентных меток — флуорофоров. Однако после возбуждения лазером электрон во флуорофоре с вероятностью ~1% может изменить свой спин и перейти в долгоживущее триплетное темное состояние, которое не флуоресцирует. Это состояние длится в ~100 000 раз дольше, чем обычное, что делает флуорофор тусклым и снижает точность измерений smFRET.
Решение: «самовосстанавливающиеся» флуорофоры
Для борьбы с этим явлением команда разработала «самовосстанавливающиеся» флуорофоры, в которых напрямую присоединен гаситель триплетных состояний (например, циклооктатетраен). Этот подход решает проблемы растворимости и контроля, присущие свободным гасителям.
Использование таких флуорофоров в качестве донора и акцептора в экспериментах smFRET:
- Снижает заселенность триплетного состояния до 1000 раз.
- Улучшает качество и надежность данных.
- Предотвращает потерю качества изображения при увеличении интенсивности лазера.
Значение для науки
Это достижение значительно расширяет возможности метода smFRET:
Повышает пространственное и временное разрешение.
Позволяет надежно количественно определять нанометровые конформационные изменения в отдельных биомолекулах.
Делает возможными измерения на суб-миллисекундных масштабах времени и при физиологических концентрациях кислорода.
«Мы уверены, что самовосстанавливающиеся флуорофоры сыграют важную роль в достижении наших целей по развитию технологий визуализации», — заявил руководитель исследования Скотт Бланшар. Этот подход имеет потенциал для улучшения большинства флуоресцентных применений.