Нацеленное секвенирование ДНК для исследования биоразнообразия растений

Технологии секвенирования третьего поколения (TGS), такие как портативный секвенатор MinION, обещают произвести революцию в биологии, но для этого потребуется доработка методик. В частности, низкий выход данных от секвенаторов TGS означает, что для обеспечения надлежащего покрытия интересующих регионов необходимо разрабатывать подходы нацеленного секвенирования. В исследовании, представленном в недавнем выпуске журнала Applications in Plant Sciences, доктор Томас Куврёр и коллеги разработали новый протокол для захвата и секвенирования длинных сегментов ДНК пластидного генома (пластома) у растений.

"Новые технологии секвенирования, такие как MinION, могут сыграть ключевую роль в ускорении открытия биоразнообразия и понимании его функционирования и эволюции, особенно в тропиках. Это связано с тем, что секвенирование становится более портативным и простым в выполнении", — сказал доктор Куврёр, автор-корреспондент статьи и директор по исследованиям Французского национального института исследований в области устойчивого развития (IRD). "Поэтому мы были заинтересованы в улучшении наших лабораторных протоколов для лучшей интеграции этих технологий в исследования биоразнообразия".

В частности, команда была заинтересована в захвате и секвенировании длинных фрагментов хлоропластной ДНК с помощью метода нацеленного секвенирования, который ранее никогда не использовался для длинных фрагментов ДНК у растений. Они разработали зонды для захвата этих длинных последовательностей и протестировали протокол на шести однодольных растениях — трёх злаках и трёх пальмах. Доктор Куврёр описывает целевой захват как "что-то вроде рыбалки. Мы, по сути, зацепляем интересующую нас ДНК, а затем секвенируем её".

Сочетание нацеленного секвенирования с технологией TGS может улучшить сборку генома — вычислительное "сшивание" множества секвенированных фрагментов ДНК в более крупные непрерывные блоки. Короткие риды, производимые старыми технологиями секвенирования (обычно длиной 100-400 пар оснований), делают биоинформатическую сборку определённых регионов генома, таких как повторяющиеся последовательности, очень сложной. Технологии секвенирования третьего поколения, такие как портативный MinION, производят более длинные риды, которые могут помочь в такой сборке. Однако эти секвенаторы обычно имеют более низкий выход данных по сравнению со старыми технологиями. Поэтому для эффективного секвенирования интересующих регионов эти регионы необходимо обогащать с помощью методов, таких как целевой захват и секвенирование.

"Более длинные фрагменты облегчают сборку геномов. Это можно сравнить с пазлом из 1000 маленьких кусочков (короткие риды) против пазла из 10 больших кусочков", — объяснил доктор Куврёр. "Наш исследовательский вопрос был прост: можем ли мы захватывать длинные фрагменты ДНК для целевого секвенирования?" Команде действительно удалось захватить длинные фрагменты ДНК пластома. Медианная длина фрагмента в среднем по испытаниям составила 3151 пар оснований, что намного длиннее фрагментов длиной ~400 пар оснований, получаемых с помощью старых технологий секвенирования.

"Этот метод можно использовать для сборки пластомов или, по крайней мере, для значительного улучшения сборки", — сказал доктор Куврёр. "Наш протокол будет особенно полезен для немодельных видов растений, для которых у нас мало или вообще нет предварительных данных о пластоме". Это может помочь в филогенетических и других анализах немодельных растений, которые представляют подавляющее большинство растительного биоразнообразия.

"Область нацеленного секвенирования быстро меняется, и улучшенные протоколы, несомненно, повысят качество сборки пластомов", — заключил доктор Куврёр. "На данный момент мы показываем, что захват и последующее секвенирование длинных фрагментов ДНК возможно, и это первый шаг".