Синтетические генетические схемы для повышения качества стволовых клеток
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS-клетки) перспективны для клеточной терапии, но их создание и дифференцировка часто приводят к нежелательной смеси клеток. Исследователи из CiRA сообщают в Science Advances о новой синтетической РНК-технологии, состоящей из ON и OFF переключателей. Эти переключатели контролируют специфические гены, чтобы уничтожать загрязняющие клетки, оставляя целевые клетки нетронутыми, с эффективностью, превосходящей стандартные методы.
Стандартные методы очистки клеток, такие как сортировка с активацией флуоресценцией или магнитная активация, требуют антител, дороги и повреждают многие клетки. Лаборатория Хирохидэ Сайто разрабатывает синтетическую РНК — «РНК-переключатели» — как альтернативу. В отличие от антител, РНК-переключатель связывается с miRNA, естественно экспрессируемой внутри клетки.
Основная функция miRNA — предотвращать трансляцию РНК в белки. Таким образом, РНК-переключатель, введённый в клетку, будет транслировать белки, пока не свяжется с miRNA. РНК-переключатель содержит комплементарную последовательность к специфической miRNA. Сконструировав переключатель для трансляции белка, вызывающего гибель клетки, выживут только клетки с высокой экспрессией miRNA, которая связывается с этой последовательностью.
В этой системе все РНК-переключатели работают как OFF-переключатели (высокий уровень miRNA выключает их). Однако при масштабировании возникают проблемы: на чистоту влияет количество введённой РНК, а также наблюдается «утечка» (нежелательные клетки выживают, а целевые гибнут).
В качестве решения команда создала РНК-переключатели, которые включаются (ON) при связывании с miRNA. Для этого потребовалось изменить структуру синтетической РНК. В отличие от OFF-переключателя, комплементарная последовательность в ON-переключателе размещена после поли(А)-хвоста мРНК, а не перед ним. После хвоста также добавлена дополнительная последовательность, блокирующая трансляцию. Связывание miRNA с этой последовательностью приводит к её расщеплению, что позволяет начать трансляцию белка.
Совместное введение клеткам miRNA ON и OFF переключателей снизило проблемы утечки и зависимости от количества РНК. Эффективность трансфекции зависит от типа клеток, их количества и других факторов. Использование пары переключателей позволяет меньше беспокоиться о строгом контроле количества вводимой РНК.
Исследователи протестировали стратегию, сконструировав ON-переключатель для трансляции Barnase (рибонуклеаза, разрушающая РНК и убивающая клетки) и OFF-переключатель для трансляции Barstar (ингибитор Barnase), чтобы устранить любую утечку экспрессии Barnase. Переключатели были настроены на связывание с miR-302a-5p (высоко экспрессируется в iPS-клетках) или с miR-208a-3p и miR-1-3p (экспрессируются в кардиомиоцитах).
В результате учёным удалось очистить популяцию iPS-клеток более чем на 99%, а кардиомиоцитов — на 95%. Эти показатели превосходят уровни чистоты, достигаемые стандартными методами.
Поскольку молекулы РНК относительно безопасны, а РНК-переключатели в принципе можно сконструировать для взаимодействия с любым типом miRNA, технология перспективна для клинических исследований. Метод применим к широкому спектру типов клеток, которые можно использовать для изучения болезней, лекарств и клеточной терапии.