Метод Грама
Метод Грама — это метод дифференциальной окраски бактерий, при котором одни бактерии окрашиваются в тёмно-фиолетовый цвет (грамположительные бактерии), а другие — в красный или розовый (грамотрицательные бактерии).
Сущность метода заключается в том, что клеточная стенка грамположительных бактерий прочно фиксирует генцианвиолет, не обесцвечивается этанолом и поэтому не воспринимает дополнительный краситель (фуксин). У грамотрицательных микробов генцианвиолет легко вымывается из клетки этанолом, и они окрашиваются дополнительным красителем.
Техника окраски
- На фиксированный препарат помещают полоску фильтровальной бумаги и на неё наносят раствор генцианвиолета на 1–2 минуты.
- Краситель и фильтровальную бумагу сливают, а препарат обрабатывают в течение 1 минуты раствором Люголя.
- Раствор Люголя сливают и на препарат наносят на 30 секунд 95% этанол.
- Препарат промывают водой, воду сливают и докрашивают дополнительным красителем (водным фуксином) в течение 1–2 минут.
- Препарат снова промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Общим правилом для всех этапов является более длительная экспозиция в случае толстых мазков (например, из материала или плотной среды) и более кратковременная, если мазки тонкие (например, из бульонной культуры).
Возможные ошибки и контроль
В связи с недостаточной стандартностью методики и возможными ошибками (перекрашивание или недоокрашивание одним из красителей, несоблюдение экспозиции или концентрации реактивов, передержка или недодержка этанола, неполное удаление воды и другие) результат окрашивания может быть неправильным. Для контроля целесообразно на том же предметном стекле рядом делать препарат из смеси заведомо грамположительных и грамотрицательных микробов.
С другой стороны, следует иметь в виду, что некоторые виды бактерий окрашиваются грамвариабельно (то есть могут давать нестабильный результат).
Современный контекст
Метод Грама, разработанный Гансом Кристианом Грамом в 1884 году, остаётся одним из фундаментальных и наиболее широко используемых методов в микробиологической практике. Он является первым этапом в предварительной идентификации бактерий и имеет важное клиническое значение, так как грамположительные и грамотрицательные бактерии часто по-разному реагируют на антибиотики (например, пенициллин более эффективен против грамположительных бактерий).
Современные исследования детально объяснили биохимическую основу метода. Разница в окрашивании обусловлена структурой клеточной стенки:
- Грамположительные бактерии имеют толстый, многослойный пептидогликановый слой, который удерживает комплекс генцианвиолет–йод и не пропускает этанол.
- Грамотрицательные бактерии имеют тонкий слой пептидогликана, покрытый наружной мембраной, содержащей липополисахариды. Этанол повреждает эту мембрану, что позволяет вымыть комплекс красителя.
Сегодня метод часто используется в автоматизированных системах идентификации микроорганизмов, но ручной вариант по-прежнему актуален в лабораториях по всему миру.