Как белки связываются с закрытыми участками генома, облегчая дифференцировку и развитие клеток
Новый экспериментальный метод позволяет исследователям изучить, как определенные белки, называемые факторами-первопроходцами (pioneer factors), могут связываться с избирательными участками генома, недоступными для других ДНК-связывающих белков.
Исследователи из Университета штата Пенсильвания, разработавшие метод, опубликовали свой подход в журнале Molecular Cell. Работа предоставляет, по их словам, «мощный» способ понять, как регулируются гены.
Геном содержит всю генетическую информацию организма, но в отдельных клетках используется лишь её подмножество. Это подмножество помогает определить, как клетки развиваются и дифференцируются для выполнения своих специализированных функций.
Белки, называемые факторами транскрипции, взаимодействуют с ДНК в геноме, чтобы контролировать конкретный набор генов, экспрессируемых в типе клетки, связываясь с короткими последовательностями ДНК, называемыми мотивами связывания. Однако часто эти мотивы недоступны для белков-факторов транскрипции из-за того, как ДНК упакована в клетке.
Под руководством Лу Бая, профессора биохимии, молекулярной биологии и физики в Колледже Эберли естественных наук в Пенсильвании, исследователи разработали новую технику, которая может тестировать тысячи вариантов последовательностей мотивов связывания в одном эксперименте.
С помощью этой техники исследователи могут начать определять особенности мотивов, которые позволяют специализированным факторам транскрипции — факторам-первопроходцам — получать доступ к этим обычно недоступным областям генома и открывать их для дополнительного доступа.
Техника также позволяет исследователям анализировать, как факторы-первопроходцы работают вместе с другими белками-кофакторами, что может объяснить, какие мотивы связываются в каких конкретных клетках.
Новый метод назван ChIP-ISO или Chromatin Immunoprecipitation with Integrated Synthetic Oligonucleotides.
«Все клетки организма содержат один и тот же геном, но не все клетки одинаковы, — сказал Бай. — Разные типы клеток различны из-за набора генов, которые они экспрессируют. Экспрессия генов регулируется факторами транскрипции, которые связываются с ДНК в определенных коротких последовательностях-мотивах, встречающихся по всему геному. Но в любой момент времени в клетке используется лишь очень небольшая часть этих мотивов, и нам интересно, как определяется эта специфичность».
Хромосомы в ядре клетки состоят из длинных нитей ДНК, упакованных с различными белками в структуру, называемую хроматином. Такая упаковка ограничивает доступность многих ДНК-связывающих факторов, включая факторы транскрипции, позволяя им связываться только с подмножеством их мотивов.
Однако факторы-первопроходцы особенные, потому что они могут связываться с ДНК даже в плотно упакованном, или «закрытом», хроматине. Несмотря на эту способность, даже факторы-первопроходцы связываются лишь с небольшой долей своих мотивов.
«Загадочно, почему факторы-первопроходцы связываются только с некоторыми из своих мотивов, поэтому мы разработали ChIP-ISO как метод для анализа характеристик ДНК-мотивов, которые позволяют им ассоциироваться или не ассоциироваться с факторами-первопроходцами, — сказал Бай. — Преимущество техники в том, что она чрезвычайно высокопроизводительна, позволяя нам тестировать тысячи вариантов последовательностей ДНК мотива связывания в одном эксперименте».
Чтобы протестировать новый метод, исследовательская группа сосредоточилась на хорошо известном факторе-первопроходце FOXA1, а также на нескольких белках-кофакторах, которые потенциально влияют на то, когда и в каких типах клеток FOXA1 связывается с ДНК.
В эксперименте ChIP-ISO исследователи создали короткие синтетические последовательности ДНК, содержащие варианты сайтов связывания для фактора-первопроходца FOXA1, а также сайты связывания белков-кофакторов. Затем исследователи интегрировали тысячи этих коротких вариантов последовательностей в геном миллионов клеток, выращенных в лаборатории. После этого они могут определить, какие варианты фактически связываются FOXA1 и его кофакторами в клетках.
«Если FOXA1 связывается с синтетическими последовательностями, которые мы ввели в клетку, мы можем захватить этот фрагмент ДНК и определить его последовательность, чтобы понять, как варианты влияют на связывание, — объяснил Бай. — Как и ожидалось, сам мотив FOXA1 важен для связывания FOXA1. Однако нас удивило, что некоторые другие факторы транскрипции рядом с мотивом FOXA1 в некоторых контекстах последовательностей могут быть почти так же важны для связывания FOXA1».
Команда обнаружила, что мутация сайтов связывания для кофакторов AP-1 и CEBPB приводит к значительному снижению связывания FOXA1. Мутация сайта связывания AP-1 оказывала особенно сильный эффект, что предполагает его решающую роль в направлении связывания FOXA1 в этих клетках. Они также обнаружили, что локальные вариации последовательности оказывали большее влияние на связывание FOXA1, чем контекст хроматина (то, насколько плотно ДНК упакована в структуру хроматина).
«В наших клетках AP-1 является наиболее важным кофактором для FOXA1, но в других типах клеток эту роль могут играть другие кофакторы, — сказал Бай. — Существует много других факторов-первопроходцев и потенциально много других кофакторов, и нам интересно анализировать эту сложную сеть. Метод ChIP-ISO дает нам платформу для тестирования комбинации различных факторов и начала понимания их роли в определении клеточной идентичности».
Исследователи также использовали нейронные сети для анализа вариаций связывания FOXA1 в разных типах клеток, используя общедоступные данные из предыдущих исследований, в которых применялись другие методы изучения FOXA1.
«Наш анализ с помощью нейронных сетей подтвердил, что мотивы других факторов транскрипции могут объяснять, почему FOXA1 связывается с разными участками в разных типах клеток», — сказал Шон Махони, доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии в Пенсильвании и соавтор статьи.
«Эта комбинация способности ChIP-ISO тестировать тысячи настроенных последовательностей ДНК с анализом на основе машинного обучения — очень мощный способ получить представление о системах регуляции генов».