Новый метод позволяет точно находить «выключатели» генов
Все клетки организма несут одну и ту же инструкцию — ДНК, но разные клетки считывают и экспрессируют разные её части, чтобы выполнять специфические функции. Например, нервные клетки экспрессируют гены, помогающие передавать сигналы, а иммунные — гены для производства антител.
Этот высокорегулируемый процесс экспрессии генов во многом и делает нас сложными организмами, а не скоплением одинаковых клеток. Однако до конца не ясно, как клетки получают доступ к нужной информации в ДНК. Известно, что процесс контролируется транскрипционными факторами — белками, которые связываются с определёнными участками ДНК и в правильной комбинации позволяют считать последовательность гена.
Функциональные сайты связывания транскрипционных факторов в ДНК notoriously difficult to locate. Огромное количество факторов и типов клеток создаёт бесконечное число возможных комбинаций. Более того, результаты полногеномного картирования только добавили путаницы, показав, что транскрипционные факторы связываются очень promiscuously по всему геному, даже с участками, которые не включают и не выключают гены.
Исследователи из Stowers Institute for Medical Research разработали высокоразрешающий метод, который может точно и надёжно картировать индивидуальные сайты связывания транскрипционных факторов в геноме, значительно превосходя стандартные техники.
Новый метод, опубликованный 9 марта 2015 года в Nature Biotechnology, позволяет выявить «отпечатки» (footprints) функциональных сайтов связывания, показывая, что транскрипционные факторы стабильно садятся на очень специфичные последовательности. В то же время, сомнительные сайты связывания, обнаруженные ранее, показали размытый неспецифичный паттерн и не считаются связанными.
«Теперь мы видим тонкости и уровень точности, которых не ожидали, — говорит ведущий автор исследования, ассоциированный исследователь Stowers Джулия Цайтлингер, Ph.D. — Мы видим не только distinct sequence motif, где связывается фактор, но и дополнительные последовательности, которые, видимо, вносят вклад в специфичность связывания».
За последние 15 лет появился ряд методов картирования сайтов связывания, все они основаны на chromatin immunoprecipitation (ChIP). ChIP-chip использует микрочипы для поиска общей области связывания, а ChIP-seq улучшает подход с помощью секвенирования, но всё равно не может указать точный адрес сайта.
Прорывной стала техника ChIP-exo, разработанная Фрэнком Пью, Ph.D., которая использует экзонуклеазу для «подстригания» фрагментов ДНК до места связывания фактора. Однако её практическая реализация оказалась сложной.
После нескольких неудачных попыток использовать ChIP-exo в своей лаборатории, Цайтлингер решила разработать собственную версию. Она поняла, что малое количество ДНК, получаемое в ChIP-exo, затрудняет получение точной последовательности. Решение пришло во время работы над несвязанной РНК-техникой.
Обычно при подготовке ДНК к анализу добавляют дополнительный бит последовательности как стартовый сайт для секвенирующей машинерии. Традиционно это требует двух неэффективных шагов лигирования — к началу и к концу образца.
Цайтлингер и коллеги нашли способ сделать это за один шаг лигирования, добавив последовательность к концу фрагмента и позволив цепи замкнуться в круг. Кроме того, они включили в лигируемую ДНК случайный штрих-код (unique barcode), что позволило отлавливать ошибки или артефакты процедуры секвенирования.
Новый метод назвали ChIP-nexus (ChIP experiments with nucleotide resolution through exonuclease, unique barcode and single ligation). При картировании «отпечатков» четырёх хорошо изученных белков — человеческого TBP и дрозофильных NF-kappaB, Twist и Max — метод стабильно превосходил существующие протоколы ChIP-seq по разрешению и специфичности.
Новый инструмент может отличить реальные «отпечатки» (когда фактор долго и прочно сидит на определённой последовательности) от фонового шума (когда белок лишь ненадолго задерживается на последовательности в поисках правильного места посадки). Лучшая коллекция реальных сайтов даёт гораздо более детальную информацию о предпочтениях связывания транскрипционных факторов.
Цайтлингер считает, что эта техника представляет важный шаг вперёд для области и в конечном итоге заменит ChIP-seq в исследованиях регуляции генов.
«У нас всё ещё очень упрощённое представление о том, как транскрипционные факторы приходят, открывают ДНК и включают гены, — говорит Цайтлингер. — Если мы проведём такой анализ для множества факторов, мы соберём информацию, необходимую для лучшего понимания экспрессии генов».
В частности, она хотела бы, чтобы метод использовали для изучения того, как небольшие изменения в ДНК — естественно существующие в человеческой популяции — влияют на связывание транскрипционных факторов и, следовательно, на различия в экспрессии генов между индивидуумами.