Новый метод высокопроизводительного скрининга позволяет исследовать загадочные белки
Исследователи из Института Скриппса и его Центра молекулярного скрининга разработали первую широко применимую технику высокопроизводительного скрининга, которая работает даже с белками, о которых известно очень мало. Метод, описанный в журнале Nature Biotechnology 29 марта 2009 года, уже позволил идентифицировать ингибиторы для двух ферментов, играющих значительную роль в прогрессировании рака.
Основная проблема в изучении белков заключается в том, что для разработки стандартных субстратных тестов необходимо знать молекулы, с которыми связывается данный белок. Однако такая информация доступна лишь для примерно трети протеома человека. Остальные две трети белков в значительной степени остаются неохарактеризованными.
Чтобы решить эту проблему, команда под руководством Бена Краветта несколько лет назад разработала широко используемую технику Activity-Based Protein Profiling (ABPP). Она использует зонды, которые присоединяются к белкам, даже когда их мишени (субстраты) неизвестны. Однако для определения результатов эксперимента ABPP требовала трудоемкого гель-электрофореза или масс-спектрометрии, что ограничивало скрининг библиотеками всего в несколько сотен молекул.
Прорыв: объединение ABPP с флуоресцентной поляризацией
Новая методика, названная fluopol-ABPP, впервые объединила ABPP с другим методом высокопроизводительного детектирования — флуоресцентной поляризацией.
Принцип работы:
- Небольшие флуоресцентные зонды, присоединенные к белкам, при облучении светом испускают флуоресценцию.
- Степень поляризации испускаемого света зависит от размера флуоресцирующей молекулы.
- Маленький свободный зонд вращается быстро, и его свет слабо поляризован.
- Когда зонд связывается с крупной белковой молекулой, вращение замедляется, и поляризация флуоресценции значительно возрастает.
- Если эффективный ингибитор связывается с белком, он конкурирует с зондом, предотвращая увеличение поляризации.
Это позволяет быстро и автоматически измерять успешность ингибирования без этапов разделения или промывки, что идеально подходит для высокопроизводительного скрининга десятков тысяч соединений.
Демонстрация метода на двух ферментах
1. Ретиобластома-связывающий белок-9 (RBBP9):
- Фермент, играющий важную роль в некоторых раковых заболеваниях, но с неизвестной биологической активностью.
- С помощью fluopol-ABPP было проскринировано почти 19 000 соединений.
- Выявлено около 20 эффективных ингибиторов, среди которых особенно выделился алкалоид эметин — природное соединение, известное своими цитотоксическими (убивающими раковые клетки) свойствами, но с неясным механизмом действия.
- Это открытие позволяет исследовать, связана ли цитотоксичность эметина с ингибированием RBBP9.
2. Глутатион-S-трансфераза омега-1 (GSTO1):
- Фермент класса оксидоредуктаз, который рассматривается как потенциальная мишень для противораковых препаратов.
- Скрининг около 2 000 молекул выявил несколько сильных ингибиторов GSTO1.
Значение и перспективы
Метод fluopol-ABPP переносим между разными классами белков и для многих ферментов внутри одного класса. Команда уже разработала десятки широкоспектральных зондов для различных классов белков.
Это открывает возможность для изучения роли и активности той загадочной двух третей человеческих белков, которые остаются неохарактеризованными, что может стать значительным скачком вперед в протеомике.