Обнаружение, связывание и разрезание: биомолекулярное действие в наномасштабе

Исследователи из Университета Канадзавы сообщают в ACS Nano, как высокоскоростная атомно-силовая микроскопия (HS-AFM) может быть использована для изучения биомолекулярных механизмов, лежащих в основе редактирования генов.

Последовательности CRISPR ("короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами") в ДНК прокариот играют ключевую роль в противовирусной защите бактерий, позволяя распознавать и нейтрализовать вирусы. Это осуществляется с помощью фермента Cas9, который может расплетать ДНК, проверять наличие последовательности CRISPR и разрезать ДНК.

CRISPR/Cas9 стал инструментом редактирования генома, но иногда он "захватывает" неправильную мишень. Поэтому крайне важно полностью понять, как Cas9 связывается с ДНК, "опрашивает" и разрезает её. Микихиро Сибата и его коллеги впервые засняли на видео динамику связывания и разрезания ДНК белком Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) с помощью HS-AFM.

Наблюдения за молекулярной динамикой

Для наблюдения молекулярной динамики SaCas9 учёные химически модифицировали поверхность слюды. Это позволило молекулам "прилипать" к подложке, но не слишком сильно, чтобы сохранялась достаточная подвижность для наблюдения биомолекулярных взаимодействий.

• Искусственная активация Cas9 происходит при связывании с молекулой однонаправляющей РНК (sgRNA), которая содержит информацию о целевой последовательности ДНК.
• Учёные наблюдали, что комплекс SaCas9-sgRNA обладает гибкой модульной структурой, способной переключаться из открытой в закрытую конфигурацию, что обеспечивает связывание с ДНК.
• Им также удалось зафиксировать момент разрезания ДНК в целевом сайте.

Долгодистанционное взаимодействие

Исследователи детально изучили механизм обнаружения целевой ДНК и нашли свидетельства того, что он включает селективное долгодистанционное взаимодействие. Хотя его точная природа остаётся неясной, учёные полагают, что ключевую роль играют гидрофобные силы между частями комплекса SaCas9-sgRNA и ДНК.

Это открытие неожиданно, поскольку до сих пор считалось, что целевая ДНК идентифицируется в основном за счёт процессов диффузии. Учёные отмечают: "Хотя настоящие наблюдения HS-AFM представляют собой прямое доказательство долгодистанного селективного взаимодействия между SaCas9-sgRNA и её целевой ДНК, необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить механизм поиска целевой ДНК, гипотетически предложенный в данном исследовании."

Высокоскоростная атомно-силовая микроскопия (HS-AFM)

В методе HS-AFM кантилевер с острой иглой на конце заставляют колебаться с резонансной частотой. При сканировании поверхности изменения амплитуды или частоты колебаний, вызванные взаимодействием иглы с образцом, регистрируются и преобразуются в карту высот.

HS-AFM позволяет получать видео, где интервал между кадрами зависит от скорости сканирования. Этот метод не использует линзы, поэтому его разрешение не ограничено дифракционным пределом. Исследователи из Университета Канадзавы развили метод HS-AFM для изучения биохимических молекул и процессов в реальном времени, что и было применено для исследования молекулярной динамики взаимодействия Cas9 с ДНК.