Два новых компактных фермента Cas9 расширят возможности редактирования генома
Ученые из Сколтеха и их коллеги из России и США описали два новых, компактных нуклеазы Cas9 — режущие компоненты систем CRISPR-Cas, которые потенциально расширят инструментарий Cas9 для редактирования генома. Одна из двух нуклеаз показала активность в клетках человека и, следовательно, может иметь биомедицинское применение. Статья опубликована в журнале Nucleic Acids Research.
Технология CRISPR-Cas, позаимствованная у бактерий, опирается на нуклеазы Cas. Эти ферменты, направляемые CRISPR РНК, могут разрезать целевые генетические последовательности. В исследовательских приложениях наиболее популярной нуклеазой Cas9 является SpCas9 из Streptococcus pyogenes (тип II-A). Она эффективна и относительно проста, так как один крупный белок и связывается с crRNA, и разрезает ДНК; также она требует короткой PAM-последовательности — строки нуклеотидов, обрамляющей сайт-мишень, которую фермент использует для его поиска и «чтения».
Однако SpCas9 — крупный белок, что создает проблему, когда требуется использовать частицу аденоассоциированного вируса (AAV) в качестве средства доставки «генетических ножниц» в клетку. В идеале хотелось бы поместить и ген, кодирующий белок Cas, и последовательности для направляющих РНК в одну частицу, а этот лимит по размеру требует более коротких вариантов Cas9. Однако такие более короткие нуклеазы, как правило, требуют более длинных и сложных PAM, поэтому исследователи сталкиваются с компромиссом между размером белка и выбором мишеней.
В новой работе Иана Федорова, недавно защитившая кандидатскую диссертацию в Сколтехе, и научный сотрудник Александра Васильева из лаборатории Константина Северинова в Сколтехе вместе с коллегами описывают две новые малые нуклеазы Cas9, полученные из Defluviimonas sp.20V17 (бактерия, обитающая в гидротермальных источниках) и Pasteurella pneumotropica (распространенная бактерия, встречающаяся у грызунов и других млекопитающих). Эти нуклеазы оказались достаточно малы для вектора на основе AAV и имеют относительно короткие PAM, что представляет собой вариант «лучшее из двух миров» для ферментов Cas9.
Новые нуклеазы относятся к системам CRISPR-Cas типа II-C, которые обычно представлены эффекторами Cas9 меньшего размера по сравнению с SpCas9. Эти белки имеют консервативную двухлопастную архитектуру, подобную другим белкам Cas9, но также обладают уникальными особенностями: им не хватает нескольких вставочных субдоменов, и у них меньше Wedge-домен (домен, ответственный за взаимодействие с каркасом однонаправляющей РНК) — и поэтому они более компактны.
«Действительно, эффекторы типа II-C, как правило, требуют более длинных PAM-последовательностей, но это лишь наблюдение, основанное на ограниченном числе охарактеризованных на сегодня эффекторов типа II-C. Например, недавно обнаруженная SauriCas9 из Staphylococcus auricularis, подобно PpCas9, требует короткой PAM (5'-NNGG-3'). И, скорее всего, вскоре будет найдено больше ферментов Cas9 типа II-C, требующих коротких PAM. Эти малые белки Cas9 с разными требованиями к PAM расширяют количество потенциально редактируемых мишеней ДНК в эукариотических и прокариотических геномах», — говорит Иана Федорова.
Исследования in vitro и эксперименты на бактериях показали, что эти две нуклеазы эффективно разрезают ДНК, а нуклеаза Cas9 из P. pneumotropica активна в клетках человека. Она также оказалась довольно похожей на другие нуклеазы Cas9, которые, как было показано, работают в эукариотических клетках, — Nme1Cas9 и Nme2Cas9. Хотя для установления эффективности этих нуклеаз требуется больше исследований, авторы полагают, что они могут стать жизнеспособной альтернативой более традиционным нуклеазам, используемым в микробной инженерии и биомедицинском редактировании генома.
Иана Федорова отмечает, что предварительные исследования внецелевой активности (непреднамеренных модификаций) PpCas9 показали, что этот фермент обладает разумной специфичностью. Но чтобы показать, что PpCas9 достаточно специфичен, чтобы рассматриваться в качестве инструмента редактирования генома, необходимы дополнительные исследования с использованием более сложных методов.
«Более того, похоже, что PpCas9 демонстрирует избирательность при нацеливании на разные гены в клетках. Это может сузить спектр возможных геномных мишеней для PpCas9, и природа этой избирательности является предметом дальнейших исследований», — добавляет она.