Обнаружен ключевой домен для повышения точности CRISPR-Cas9
Ученые из Калифорнийского университета в Беркли и Массачусетской больницы общего профиля определили ключевую область в белке Cas9, которая управляет точностью нацеливания CRISPR-Cas9 на последовательность ДНК. Изменив ее, они создали гиперточный редактор генов с самым низким на сегодня уровнем нецелевого разрезания.
Исследователи установили, что белковый домен REC3 является главным регулятором разрезания ДНК и очевидной мишенью для реинжиниринга с целью дальнейшего повышения точности. Этот подход поможет создать варианты Cas9 — белка, связывающего и разрезающего ДНК, — которые сведут к минимуму риск редактирования не в том месте, что критически важно для генной терапии у людей.
Одна из стратегий — создавать мутации в домене REC3 и отбирать те, что повышают точность, не снижая эффективность целевого разрезания.
«Мы обнаружили, что даже незначительные изменения в домене REC3 Cas9 влияют на разницу между целевым и нецелевым редактированием. Это говорит о том, что данный домен — очевидный кандидат для углубленного мутагенеза с целью улучшения специфичности нацеливания», — отметила соавтор исследования Джанис Чен.
Чен и ее коллеги из нескольких институтов сообщают о результатах онлайн в журнале Nature.
Гиперточный Cas9
С 2012 года, когда Дженнифер Даудна и Эмманюэль Шарпантье адаптировали белок Cas9 для создания дешевого, точного и простого редактора генов, исследователи искали способы снизить вероятность нецелевого редактирования. Повышенная точность критически важна для клинического применения, так как любое нецелевое разрезание ДНК может повредить ключевые гены и привести к неожиданным побочным эффектам.
За последние два года были созданы высокоточные варианты Cas9 — eSpCas9(1.1) и SpCas9-HF1. Чен и Даудна решили выяснить, почему они режут с более высокой специфичностью, чем широко используемый «дикий» белок Cas9 из Streptococcus pyogenes.
Обычно исследователи создают однонаправляющую РНК (sgRNA), комплементарную целевой 20-нуклеотидной последовательности ДНК, и присоединяют ее к Cas9. Этот комплекс может связываться и с не полностью комплементарной ДНК, что приводит к нежелательному разрезанию.
В 2015 году лаборатория Даудна обнаружила конформационный переключатель Cas9, который активируется при точном совпадении РНК-гида и ДНК-мишени. Однако процесс, ответственный за распознавание нуклеиновых кислот до этого переключения, оставался неизвестным.
В новом исследовании Чен и ее коллеги использовали метод одно-молекулярного FRET (Förster resonance energy transfer), чтобы измерить, как движутся различные белковые домены в комплексе Cas9-sgRNA (в частности, REC3, REC2 и HNH) при связывании с ДНК.
Сначала они выяснили, что повышенная специфичность eSpCas9(1.1) и SpCas9-HF1 объясняется тем, что порог для конформационного переключения HNH у этих вариантов намного выше, чем у «дикого» Cas9. Это делает их менее склонными активировать «ножницы» при связывании с нецелевой последовательностью.
Затем они обнаружили, что домен REC3 отвечает за оценку точности связывания с мишенью. Он посылает сигнал, который приводит к повороту домена REC2, открывая путь для нуклеазного домена HNH и активируя разрезание. Эта активная конформация Cas9 способна разрезать обе цепи целевой ДНК.
Далее исследователи показали, что мутирование частей REC3 позволяет изменить специфичность белка Cas9 так, чтобы HNH активировался только при очень близком совпадении РНК-гида и ДНК-мишени. Им удалось создать улучшенный гиперточный Cas9, названный HypaCas9, который сохраняет эффективность на целевых участках, но лучше различает целевые и нецелевые сайты в клетках человека.
«Если мутировать определенные аминокислотные остатки в REC3, можно настроить баланс между активностью Cas9 на цели и улучшенной специфичностью. Мы нашли "золотую середину", где есть достаточная активность на нужной мишени, но и большое снижение нецелевых событий», — пояснила Чен.
Продолжая изучать взаимосвязи между структурой, функцией и динамикой Cas9, команда надеется дальше модифицировать белок для надежного и эффективного выполнения различных генетических изменений.