Новый вариант Cas9 делает редактирование генома ещё более точным

CRISPR-Cas9 произвело революцию в генетике благодаря способности разрезать ДНК в заданных участках. Исследователи используют фермент Cas9 для целенаправленного отключения генов или вставки новых фрагментов ДНК в геном. Однако, как бы специфичен ни был Cas9, иногда он режет не там, где нужно. Учёные из Института науки о патогенах Общества Макса Планка в Берлине и Медицинского факультета Университета Мартина Лютера Галле-Виттенберг сообщают о варианте Cas9, который повышает специфичность редактирования генома.

Чтобы Cas9 разрезал цель в ДНК, его нужно направить в нужный участок с помощью направляющей РНК (guide RNA). Эта РНК содержит комплементарную последовательность цели, работая как «почтовый индекс» для Cas9. «Иногда Cas9 может разрезать и последовательности ДНК, очень похожие на настоящую цель — так называемые off-targets», — объясняет Эмманюэль Шарпантье, директор Института.

Эта нежелательная активность CRISPR-Cas9 может приводить к ошибкам в редактировании генома. «Непреднамеренный разрез в неправильном месте человеческого генома может иметь серьёзные последствия. Поэтому нам нужна более специфичная система», — говорит Михаэль Бётчер, доцент Медицинского факультета.

Учёные пытаются оптимизировать специфичность Cas9 разными подходами. В текущем исследовании команда из Берлина и Галле сосредоточилась на эволюционно консервативном домене Cas9, известном как bridge helix (мостовая спираль).

Аминокислоты формируют стабильную петлю

Исследователи обнаружили, что bridge helix играет критическую роль в механизме взаимодействия Cas9 с направляющей РНК и целевым участком ДНК. Они идентифицировали группу аминокислотных остатков, которые контактируют с фосфатным остовом направляющей РНК, облегчая формирование стабильной петли, необходимой для активности Cas9. В такой петле направляющая РНК, связанная с Cas9, спаривается с комплементарной цепью ДНК-мишени, вытесняя вторую цепь, что позволяет Cas9 разрезать обе цепи ДНК.

Учёные создали новые варианты Cas9, изменив эти аминокислотные остатки, и обнаружили, что несколько вариантов режут off-target-сайты гораздо реже, чем исходный фермент. Они также показали, что один из идентифицированных вариантов, R63A/Q768A, повысил специфичность редактирования генов Cas9 и в человеческих клетках. «Наши результаты дают новую основу для дальнейшей оптимизации CRISPR-Cas9. Они демонстрируют необходимость получения большего знания о биохимии систем CRISPR-Cas для их дальнейшего улучшения», — говорит Шарпантье.