Улучшенные редакторы оснований: новые инструменты CRISPR для точного редактирования генома
Инструменты CRISPR для редактирования генов, такие как редакторы оснований, обладают терапевтическим потенциалом, но имеют технические недостатки: нежелательные побочные правки и ограниченный доступ к участкам ДНК.
В двух статьях в Nature Biotechnology исследователи из Broad Institute, Гарварда и Медицинского института Говарда Хьюза представили новые CRISPR-инструменты, решающие эти проблемы.
Снижение побочных эффектов
Редакторы оснований меняют отдельные «буквы» ДНК (A, C, T, G). Однако цитозиновые редакторы оснований (преобразующие C•G в T•A) иногда выполняют нецелевые правки в случайных местах генома (Cas9-независимое редактирование).
Команда разработала пять новых тестов для быстрого и дешёвого обнаружения таких правок без полного секвенирования генома. Протестировав 14 основных цитозиновых редакторов, они выявили наиболее точный вариант — YE1. Он показал снижение нецелевого редактирования в 10–100 раз.
Изначально YE1 мог редактировать только три ближайших основания. Учёные модифицировали его, расширив «досягаемость» до пяти оснований, создав более точный и универсальный набор редакторов.
«Поскольку эра редактирования человеческого генома только начинается, мы должны минимизировать риск любых побочных эффектов», — отметил старший автор работ Дэвид Лю.
Расширение доступа к геному
Другая проблема — ограниченная доступность генома для CRISPR. Белок SpCas9 может связываться только с участками, имеющими специфическую короткую последовательность — PAM. Самый распространённый PAM, NGG (где N — любое основание), встречается лишь в ~6.25% генома (примерно 1 из 16 мест).
Используя метод PACE (фаг-ассистированная непрерывная эволюция), учёные заставили SpCas9 быстро эволюционировать. В результате были получены три новых семейства вариантов SpCas9, способных узнавать PAM-последовательности без гуанина (G).
Коллективно новые варианты могут связываться с PAM вида NR (где R — это A или G), получая доступ примерно к половине всех сайтов ДНК. Учитывая, что редакторы оснований действуют в окне из пяти оснований, вероятность того, что в таком окне не окажется ни A, ни G, составляет всего 5%.
«95% известных патогенных точковых мутаций имеют подходящий NR PAM для редактирования основанием», — заявил Лю.
Редактирование мутации серповидноклеточной анемии
Новые варианты SpCas9 успешно применили для редактирования мутации, вызывающей серповидноклеточную анемию. Ранее этот сайт было сложно достичь, так как в нужном месте не было последовательности NGG.
«Используя один из эволюционировавших вариантов SpCas9, мы теперь можем достаточно эффективно редактировать эту мутацию», — добавил Лю.
Эти достижения значительно повышают точность и охват редактирования оснований, открывая путь к терапии многих генетических заболеваний.