Редакторы оснований CRISPR могут вызывать широкий спектр нецелевых редактирований РНК

Исследовательская команда из Массачусетской больницы общего профиля (MGH) сообщает, что несколько недавно разработанных редакторов оснований CRISPR, которые создают целевые изменения в одном основании ДНК, могут вызывать широко распространенные нецелевые эффекты в РНК, выходящие за пределы целевой ДНК. Их отчёт, опубликованный онлайн в журнале Nature, также описывает создание вариантов редакторов оснований, которые значительно снизили частоту редактирований РНК, одновременно повысив точность целевого редактирования ДНК.

Большинство исследований нецелевого редактирования оснований было сосредоточено на ДНК, но было обнаружено, что эта технология также может вызывать большое количество изменений в РНК. Это неожиданное открытие предполагает необходимость рассматривать не только генетические изменения при оценке непреднамеренных нецелевых эффектов редакторов оснований в клетках. Также показана возможность уменьшения этих эффектов путём создания вариантов, которые избирательно снижают нецелевое редактирование РНК, сохраняя при этом целевую активность по редактированию ДНК.

В отличие от нуклеаз CRISPR-Cas, которые вызывают целевые двуцепочечные разрывы ДНК для внесения генетических изменений, редакторы оснований CRISPR способны изменить один нуклеотид в цепи ДНК, не вызывая таких разрывов. Если нуклеазы CRISPR-Cas можно сравнить с ножницами, то редакторы оснований — с карандашом. Белки-слияния, использующие модифицированную форму CRISPR-Cas для наведения на целевую последовательность, содержат фермент деаминазу для модификации конкретного нуклеотида, создавая изменения, которые могут привести к специфическим изменениям ДНК — например, превращению цитозина в тимин.

Хотя большинство исследователей сосредоточились на активности редакторов оснований по редактированию ДНК, деаминаза в наиболее часто используемом редакторе цитозин-в-тимин изначально была идентифицирована по своей способности модифицировать РНК. Это побудило команду MGH исследовать, может ли она вызывать нецелевые эффекты в РНК.

Эксперименты в клеточных линиях печени и эмбриональных клеток почки показали, что, хотя протестированный широко используемый редактор оснований эффективно вносил изменения в целевом сайте ДНК, он также приводил к десяткам тысяч изменений цитозин-в-урацил по всему транскриптому — всему спектру транскрибированной РНК в клетке. Аналогичные результаты были получены при тестировании одного из новых редакторов оснований, нацеленных на аденин.

Для исследования возможности уменьшения или устранения нежелательных редактирований РНК команда MGH проанализировала 16 редакторов с модифицированными версиями ферментов деаминаз, идентифицировав два из них, которые были столь же эффективны, как и исходная версия, в индукции целевых эффектов на ДНК, но вызывали заметно меньше редактирований РНК. Фактически, эти варианты SECURE (SElective Curbing of Unwanted RNA Editing — избирательное сдерживание нежелательного редактирования РНК) были даже более точными, чем неизменённая деаминаза, в индукции желаемых редактирований ДНК.

Исследование показало, что широко используемый изученный редактор цитозиновых оснований оказывает умеренное влияние на жизнеспособность клеток при экспрессии в одной линии человеческих клеток, в то время как варианты SECURE — нет. Для исследовательских применений учёным, использующим редакторы оснований, необходимо учитывать потенциальные нецелевые эффекты на РНК в своих экспериментах. Для терапевтических применений результаты дополнительно указывают на важность ограничения продолжительности экспрессии редактора оснований минимально возможным временем и важность минимизации и учёта потенциального влияния этих эффектов в оценках безопасности.

Плазмиды, кодирующие варианты редакторов оснований SECURE, будут доступны в репозитории плазмид Addgene.