Новая платформа CRISPR расширяет возможности редактирования РНК

Инструменты на основе CRISPR революционизировали нашу способность воздействовать на связанные с болезнями генетические мутации. Технология CRISPR включает растущее семейство инструментов для манипуляции генами и их экспрессией, в том числе с помощью нацеливания на ДНК ферментами Cas9 и Cas12 и нацеливания на РНК ферментом Cas13. Нацеливание на мутации в РНК, которая относительно недолговечна, позволило бы избежать внесения постоянных изменений в геном.

Исследователь из Института Макговерна и член Broad Institute MIT и Гарварда Фэн Чжан и его команда разработали новую стратегию под названием RESCUE (RNA Editing for Specific C to U Exchange), описанную в журнале Science.

Команда использовала деактивированный Cas13, чтобы направить RESCUE к целевым цитозиновым основаниям в транскриптах РНК, и новый, эволюционировавший, программируемый фермент для преобразования нежелательного цитозина в уридин — тем самым изменяя инструкции в РНК. RESCUE основана на технологии REPAIR, ранее разработанной командой Чжана для изменения адениновых оснований на инозин в РНК.

RESCUE значительно расширяет область мишеней для инструментов CRISPR, включая впервые модифицируемые позиции в белках, такие как сайты фосфорилирования. Эти сайты действуют как переключатели «вкл/выкл» активности белка и часто встречаются в сигнальных молекулах и путях, связанных с раком.

«Чтобы лечить разнообразие генетических изменений, вызывающих болезни, нам нужен набор точных технологий. Разработав этот новый фермент и объединив его с программируемостью и точностью CRISPR, мы смогли заполнить критический пробел в инструментарии», — говорит Фэн Чжан.

Расширение охвата редактирования РНК на новые мишени

Платформа REPAIR использовала нацеленный на РНК CRISPR/Cas13 для направления активного домена редактора РНК ADAR2 к специфическим транскриптам РНК, где он мог преобразовывать основание аденин в инозин (A в I). Команда взяла конструкцию REPAIR и эволюционировала её в лаборатории, пока она не смогла изменять цитозин на уридин (C в U).

RESCUE может быть направлена на любую выбранную РНК для выполнения редактирования C-to-U. Команда протестировала платформу в клетках человека, показав возможность нацеливания как на естественные РНК в клетке, так и на 24 клинически значимые мутации в синтетических РНК. Затем RESCUE была дополнительно оптимизирована для снижения нецелевого редактирования.

Новые мишени в поле зрения

Расширенный охват RESCUE означает, что теперь можно редактировать сайты, регулирующие активность и функцию многих белков через посттрансляционные модификации, такие как фосфорилирование, гликозилирование и метилирование.

Ключевое преимущество редактирования РНК — его обратимость, в отличие от изменений на уровне ДНК. Таким образом, RESCUE можно применять временно. Команда показала, что в клетках человека RESCUE может нацеливаться на специфические сайты в РНК, кодирующей β-катенин, что приводит к временному увеличению активации β-катенина и росту клеток. Такое временное изменение могло бы потенциально стимулировать заживление ран.

Исследователи также нацелились на патогенный генный вариант APOE4 — фактор риска развития болезни Альцгеймера с поздним началом. Изоформа APOE4 отличается от APOE2 (не являющейся фактором риска) всего двумя нуклеотидами (C в APOE4 против U в APOE2). Команда показала, что RESCUE может преобразовывать эти C в последовательность APOE2, фактически превращая вариант риска в вариант без риска.

Для содействия дальнейшим исследованиям и продвижению RESCUE в клинику лаборатория Чжана планирует широко распространять систему RESCUE через некоммерческий репозиторий плазмид Addgene.