Nested CRISPR: эффективное редактирование генома длинными фрагментами ДНК
CRISPR — это техника, революционизирующая биомедицинские исследования благодаря высокоточной редактуре генома. Однако, несмотря на относительную простоту создания или коррекции мутаций из одного или нескольких нуклеотидов, у неё есть ограничения для работы с более крупными фрагментами ДНК. Например, вставка в геном гена, кодирующего флуоресцентный белок (например, широко используемый GFP), отличается низкой эффективностью и сложными этапами клонирования.
Группа доктора Серона из Института биомедицинских исследований Бельвитже (IDIBELL) использовала модельный организм Caenorhabditis elegans для оптимизации техники, что привело к разработке метода nested CRISPR (вложенный CRISPR). Этот метод, не требующий клонирования, предполагает вставку длинных фрагментов ДНК в два этапа:
- В геном вставляется небольшая часть (менее 200 нуклеотидов) длинного фрагмента.
- Этот небольшой фрагмент служит "гнездом" или "посадочной площадкой" для эффективной вставки более длинного фрагмента (примерно в один килобазу).
Работа, недавно опубликованная в журнале Genetics, вызывает беспрецедентный интерес. Модельные организмы с коротким жизненным циклом, такие как C. elegans, позволяют исследовать как возможности, так и ограничения CRISPR. Исследователи провели сотни микроинъекций в зародышевую линию C. elegans и тысячи генотипирований, чтобы убедительно продемонстрировать эффективность nested CRISPR.
Nested CRISPR использует коммерческие олигонуклеотиды для первого этапа репарации ДНК и универсальные ПЦР-продукты для второго. Это облегчает масштабные эксперименты, делая возможным мечение сотен генов флуоресцентными белками. Поскольку метод модульный, вместе с флуоресцентными белками можно интегрировать и дополнительные пептиды или белки. Например, группа сейчас работает над добавлением к флуоресцентным белкам пептидов, позволяющих контролируемо их деградировать.
Группа по моделированию заболеваний на C. elegans под руководством доктора Серона в IDIBELL планирует использовать nested CRISPR для замены генов C. elegans на их человеческие аналоги. Это позволит использовать этого нематоду в качестве многоклеточной модели для изучения эффекта человеческих мутаций, связанных с болезнями. Такая система представляет большой интерес для персонализированной медицины, так как может быстро и эффективно давать прогноз относительно патогенности мутации или геномного варианта (полиморфизма).