Скрининг повышает эффективность CRISPR-редактирования генома
Системы вроде CRISPR-ассоциированных транспозонов (CAST) предлагают целенаправленный одноэтапный способ редактирования геномов, но их адаптация для биомедицинских применений была сложной.
Чтобы решить эту проблему, учёные из Детской исследовательской больницы Сент-Джуд разработали скрининговый подход для точного измерения эффективности и специфичности тысяч вариантов CAST.
Этот высокопроизводительный подход позволил быстро оптимизировать перспективные кандидаты CAST и раскрыть механистические детали, важные для дальнейшей инженерии и потенциального клинического применения.
Результаты опубликованы в Nucleic Acid Research.
Обнаруженные в 2017 году, CAST интегрируют крупные фрагменты ДНК в геном в местах, заданных определённой последовательностью РНК. Они высокоспецифичны в бактериях, но плохо работают в клетках человека.
Соответственно, автор исследования Элизабет Келлогг заинтересована в доработке CAST для применения у человека и других организмов. Для этого нужен быстрый способ оценить сильные и слабые стороны сконструированных систем.
"Главным пробелом в понимании CAST было не просто измерение их общей активности, но и точности интеграции ДНК в заданные места", — сказала Келлогг. — "Просто не было масштабируемого способа охарактеризовать их специфичность".
Скрининг на специфичность и эффективность
Исследователи создали высокопроизводительный скрининг для измерения относительной активности и специфичности тысяч вариантов CAST в одном эксперименте. Сосредоточившись на подтипе V-K CAST, который менее сложен, они смогли вносить небольшие изменения в его белки и быстро тестировать мутанты.
"Мы хотели проскринировать библиотеку со всеми возможными единичными мутациями, чтобы изучить мутационный ландшафт системы CAST", — сказал соавтор Сон Гук Пак.
После скрининга мутаций V-K CAST учёные объединили несколько наиболее перспективных мутаций, чтобы проверить их совокупный эффект.
"Всего несколько мутаций увеличили активность в пять раз", — отметила Келлогг. — "Мы улучшили и специфичность, и активность, не жертвуя ни одним из параметров, что было невозможно при прежних стратегиях".
Келлогг продолжит работу над улучшением дизайна CAST. "Естественная система очень сложна, поэтому нам нужно разработать более минималистичные системы. Но этот скрининг теперь позволяет нам быть амбициознее в дизайне белков, чтобы в конечном итоге достичь этой цели".