Новый инструмент для быстрого анализа CRISPR-редактирования выявляет частые нецелевые изменения
Исследование, опубликованное в Communications Biology, описывает новый инструмент, который может ускорить разработку методов лечения с помощью CRISPR, быстро выявляя нецелевые и потенциально вредные изменения, вносимые в процессе редактирования генов.
"Мы разработали новый процесс для быстрого скрининга всех изменений, вносимых CRISPR, и он показывает, что вокруг сайта CRISPR-репарации может происходить гораздо больше непреднамеренных изменений ДНК, чем считалось ранее", — заявил доктор философии Эрик Кмич, директор Института редактирования генов ChristianaCare и ведущий автор исследования.
Новый инструмент, разработанный в Институте редактирования генов, позволяет всего за 48 часов идентифицировать "множественные результаты CRISPR-направленного редактирования генов". Обычно этот процесс требует до двух месяцев дорогостоящего и сложного анализа ДНК.
Речь идет о "тонких мутациях" в ДНК вокруг непосредственного участка генома, выбранного для репарации. Это отличается от широко обсуждаемого риска "внецелевых" мутаций, когда CRISPR делает случайные разрезы вдали от целевого сайта.
"Во всех случаях мы по-прежнему наблюдали фантастический уровень успешных репараций, достигнутых CRISPR, который был бы немыслим даже пять лет назад, — сказала ведущий автор Бретт Сансбери. — Но мы также видели множество других изменений в ДНК рядом с местом репарации".
Эти изменения включали делеции, дупликации и перестройки генетического кода. Исследователи полагают, что подавляющее большинство таких нецелевых правок может не иметь последствий для пациентов, но их важно выявлять и оценивать потенциальные риски. Например, непреднамеренные изменения могут "проинструктировать" ген производить вредный белок.
"CRISPR, вероятно, никогда не будет работать идеально в 100% случаев, — отметил Кмич. — Но если мы сможем достичь точности в 70 или 80% и понять важность любых сопутствующих изменений, это приблизит нас к безопасному использованию CRISPR для лечения пациентов".
Как работает новый инструмент?
Ученые обошли проблему сложного анализа, работая с системой, которая выполняет редактирование генов на плазмидах — кольцевых сегментах ДНК, извлеченных из клетки. Работа в этой "бесклеточной" системе устраняет сложную биологическую активность внутри клетки, которая мешает изолировать полный спектр изменений ДНК, вносимых CRISPR.
Это позволяет "визуализировать широкий спектр генетических модификаций, созданных в процессе CRISPR-направленного редактирования генов, простым и понятным способом". Инструмент также позволяет ученым проводить и проверять множество пробных редактирований, выявляя редкие нецелевые мутации, которые в противном случае остались бы незамеченными.
Вариации эффективности
Исследование показало, что частота "точной репарации" (без внесения нецелевых мутаций) значительно варьировалась в зависимости от используемого фермента (например, Cas9 или Cas12a) и ДНК-шаблона для репарации, составляя от 5% до 64%.
Эта работа является частью более широких усилий Института по редактированию плазмид. Команда уже использует "бесклеточный" подход для одновременного внесения множественных правок и сотрудничает с биотехнологической компанией для разработки новых подходов к персонализированному лечению рака.