Исследователи разделили фермент для создания генетической логической схемы
Исследователи из Университета Райса нашли способ разделить и модифицировать ферменты, чтобы создать, по сути, генетическую логическую схему (логический вентиль).
Биохимик Мэтью Беннетт и аспирант Дэвид Шис создали библиотеку вентилей И (AND), мутируя белок бактериального вируса. Хорошо изученный белок, известный как T7 РНК-полимераза (RNAP), является мощным активатором транскрипции в клетках.
Их открытие должно помочь преодолеть узкое место в разработке синтетических генетических сетей, имитирующих цифровые схемы. Эти сети могут стать диагностическими системами, которые ищут признаки болезни, и, возможно, генотерапией для поиска и лечения заболевания в один шаг.
Исследование появилось в сети на этой неделе в Proceedings of the National Academy of Sciences.
"Логические вентили И обычно встречаются в электронике: у вас есть схема с двумя входами и одним выходом", — сказал Беннетт. — "В вентиле И, если оба провода, ведущие к вентилю, включены, то выход также включен. Если один или оба выключены, то выход отключен".
Исследователям, ищущим надежные и гибкие компоненты для своих синтетических схем, было доступно мало вариантов. Библиотека вентилей И, созданная в Райсе, должна значительно пополнить инструментарий для построения более крупных и сложных генетических схем, считает Беннетт.
В своем нативном, полноразмерном состоянии T7 RNAP включает гены, имеющие специфическую "промоторную" последовательность ДНК. Исследователи из Райса обнаружили, что могут запрограммировать ДНК на экспрессию РНК-полимеразы в виде двух частей, которыми можно манипулировать с помощью точечных мутаций для нацеливания на разные промоторы в клетке-хозяине.
"Две части РНК-полимеразы могут быть произведены даже в разных частях клетки, и они все равно найдут друг друга", — сказал Беннетт. — "У них есть сродство друг к другу, и как только они объединятся, они будут работать вместе, как будто их не разделяли".
Фермент выполнял свою функцию только тогда, когда присутствовали обе половины разделенной РНК-полимеразы. Беннетт и Шис модифицировали бактерию E. coli для производства сегментов РНК-полимеразы в ответ на специфические молекулы сахара в окружающей среде. Одна половина РНК-полимеразы производится только в присутствии арабинозы, а другая — в присутствии лактозы. Когда оба сахара обнаруживались, их полимераза, созданная в качестве доказательства концепции, включала целевой ген, в данном случае репортерный ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок.
Более того, РНК-полимераза была ортогональной; то есть она не взаимодействовала с нативными белковыми путями E. coli.
"Эта особая T7 РНК-полимераза не будет включать никакой другой ген, кроме своей конкретной мишени", — сказал Беннетт. — "Таким образом, она прозрачна для хозяина. Это дает нам простой способ определить, работает она или нет".
Исследователи обнаружили, что, хотя разделенная T7 РНК-полимераза была не так активна в экспрессии белковых продуктов, как полноразмерная полимераза, ее части были более стабильны и менее склонны к мутациям, которые могли бы повлиять на функцию генетической схемы.
Беннетт сказал, что следующим шагом будет тестирование разделенной РНК-полимеразы на хозяевах, отличных от E. coli.
"Мы хотим перенести это в более сложные организмы: эукариоты, такие как дрожжи, рыбки данио или клетки млекопитающих. Потребуется немного инженерии, чтобы заставить их работать в более сложных организмах".
Он видит в передовой диагностике разумную цель для генетических схем, использующих вентили И.
"Два входа могут быть запрограммированы на реакцию на отдельные условия, будь то факторы окружающей среды вне организма или тканеспецифичные маркеры внутри многоклеточного организма", — сказал Беннетт.
"Например, вашими входами могут быть маркеры рака, которые запускали бы репортерный ген флуоресценции для диагностики или супрессоры опухолей для лечения", — сказал он.
Кроме того, несколько вентилей из библиотеки можно комбинировать и наслаивать для создания более сложных схем, одновременно отслеживающих множество переменных.
"Это означает, что вы можете построить схемы, которые включаются только при очень специфических условиях, что важно, если вы хотите уничтожить опухолевые клетки, не повреждая здоровые ткани".