Обработка образцов кожи ферментом улучшает анализ микробиома

Здоровая кожа имеет бактериальный щит для защиты от микробов: микробиом. Этот сложный комплекс микроорганизмов ранее считалось трудно расшифровать. Команде исследователей удалось использовать фермент бензоназу для идентификации живых бактерий в мазках с кожи с помощью секвенирования. Их метод открывает новые возможности для диагностики и лечения в дерматологии.

При многих кожных заболеваниях, таких как атопический дерматит и акне, защитный бактериальный слой кожи поврежден. «Наша цель — понять роль, которую в таких заболеваниях играют различные виды кожных бактерий», — говорит д-р Мартин Кёберле, руководитель лаборатории дерматоинфектологии клиники Klinikum Rechts der Isar Технического университета Мюнхена (TUM).

Предыдущие попытки дерматологов исследовать детальный состав микробиома сталкивались с препятствиями. Причина: в обычных культурах, выращенных на агаровых пластинах, не все бактерии растут и размножаются одинаково хорошо. В результате некоторые медленнорастущие виды могут быть полностью упущены. Недостатком более новых генетических методов анализа является захват большого количества последовательностей ДНК из клеток кожи и фрагментов мертвых бактерий. Это снижает информативность результатов.

Отделение генетической пшеницы от плевел

Д-р Кёберле и биолог д-р Ясин Амар, оба из команды проф. Биддерманна в клинике и поликлинике дерматологии и аллергологии TUM, в сотрудничестве с международной междисциплинарной командой разработали метод удаления ДНК нецелевых видов. Они использовали особую характеристику фермента бензоназы. Он разрушает цепи нуклеотидов, несущие наследственную информацию во всех живых существах, расщепляя их на короткие фрагменты. Только живые бактерии, чья ДНК защищена внешней клеточной стенкой, избегают разрушения ферментом.

Бензоназа уже некоторое время используется, например, для очистки белков: ферменты разрушают все чужеродные фрагменты ДНК и РНК. Их затем можно удалить в центрифуге, оставив белки. Отбор кожных бактерий работает по тому же принципу: генетический материал из клеток кожи или мертвых бактерий расщепляется ферментом, а затем может быть отделен от образца. Оставшиеся бактерии можно разрушить механически, что позволит изучить их ДНК.

«Наши эксперименты показали, что с помощью этого метода мы действительно можем полностью устранить нецелевую ДНК и отобрать кожный микробиом», — говорит руководитель проекта Ясин Амар. В лаборатории он сначала изучал искусственные образцы, содержащие смесь человеческих клеток, а также мертвых и живых бактерий, созданных по строгому протоколу и предварительно обработанных бензоназой. «Последующий процесс — известный как 16S секвенирование — дал высокоточную картину состава интактных бактерий», — говорит исследователь. Анализ реальных кожных мазков был столь же успешным: в образцах не было обнаружено остаточной ДНК от мертвых бактерий.

Д-р Кёберле уверен, что этот подход также будет играть ключевую роль в будущих исследованиях: «Ферментный отбор живых кожных бактерий может помочь нам найти микробные биомаркеры для определенных дерматологических заболеваний, а также идентифицировать бактерии, оказывающие положительное влияние на течение болезни. Возможно, однажды они будут использоваться в лечении». Новый метод анализа микробиома уже используется во многих когортных исследованиях кожных заболеваний в клинике и поликлинике дерматологии TUM.