Использование более специфичных «генетических ножниц» может избежать проблем, связанных с редактированием генов

Недавние исследования указали на потенциальное препятствие для превращения методов редактирования генов CRISPR в жизнеспособный вариант лечения наследственных заболеваний крови, таких как серповидноклеточная анемия, талассемия и синдромы первичного иммунодефицита. Стволовые клетки могут реагировать на редактирование своих генов остановкой деления, а попытки обойти это препятствие могут увеличить риск рака.

Исследование ученых из Италии показало возможный способ обойти эти осложнения. Команда обнаружила, что использование более точной технологии редактирования генов, вызывающей меньше разрывов в ДНК, может держать под контролем естественные пути реакции стволовых клеток на повреждения. Результаты опубликованы 21 марта в журнале Cell Stem Cell.

Одним из барьеров для успешного редактирования генома оказался белок p53, часто называемый «хранителем генома» из-за его роли в сохранении стабильности ДНК и предотвращении мутаций. Когда CRISPR редактирует гены, он разрезает обе цепи ДНК в определенных местах. Эти двуцепочечные разрывы могут сигнализировать p53 о проблеме. Белок активируется и предотвращает пролиферацию клеток, что противоположно желаемому результату при использовании клеток в терапии. Однако постоянное отключение p53 для блокировки этого защитного механизма может привести к образованию опухолей; дефектный p53 связан примерно с половиной всех случаев рака.

Команда из Милана нашла способ избежать этого нежелательного последствия. Редактирование генов использует нуклеазы в качестве «генетических ножниц» для создания разрывов ДНК, после чего аденовирусный вектор доставляет корректирующую последовательность. Но если эти «ножницы» недостаточно специфичны, они могут разрезать ДНК во многих дополнительных местах. Исследователи использовали комбинацию высокоспецифичных нуклеаз и векторов, чтобы создать только целевой разрыв в ДНК гемопоэтических стволовых/прогениторных клеток (ГСК).

Ученые показали, что воздействие редактирования генов на ГСК сильно зависит от точности используемой нуклеазы. Если нуклеазы недостаточно специфичны и разрезают ДНК не только в намеченной мишени, но и в нескольких дополнительных сайтах, наблюдается сильная и продолжительная реакция p53, ведущая к негативным эффектам вплоть до необратимой остановки клеток.

С другой стороны, если нуклеаза высокоспецифична, а также используются высокоочищенные реагенты и оптимизированные протоколы, наблюдается лишь временное влияние на пролиферацию клеток. Этот эффект полностью обратим и совместим с сохранением важных биологических свойств гемопоэтических стволовых клеток.

Работа демонстрирует, что ГСК хорошо переносят один или несколько разрывов ДНК, с лишь временной активацией p53 и ограниченным влиянием на их функциональность (в основном проявляющимся в задержке пролиферации). Если же временно инактивировать ответ p53 во время редактирования генов, можно противодействовать этому эффекту и повысить выход отредактированных клеток без признаков увеличения мутаций или нестабильности генома.

Исследователи отмечают, что другая серьезная проблема — относительно низкая эффективность гомологичной рекомбинации в ГСК, необходимой для введения корректирующей последовательности, — теперь существенно снижена благодаря новым методикам.

Эта работа предоставляет молекулярные доказательства осуществимости и эффективности генной инженерии в ГСК, что вселяет уверенность в успешный переход технологии к клиническим испытаниям на людях.