Исследование искусственных хромосом проливает свет на генную терапию

Исследовательская группа под руководством доцента Карен Винг И Юэнь из Школы биологических наук Гонконгского университета раскрыла механизм формирования искусственных хромосом (ИХ) в эмбрионах модельного организма Caenorhabditis elegans — прозрачной нематоды длиной 1 мм.

Результаты опубликованы в виде двух последовательных статей в журнале Nucleic Acids Research. Исследования позволили лучше понять механизмы сборки ДНК и формирования новых центромер, а также способствовали разработке ИХ для клонирования и генной терапии. Доктор Карен Юэнь и доктор Чжунъян Линь обнаружили in vivo (в живом организме) клеточные белки, которые обрабатывают чужеродные фрагменты "голой" ДНК, чтобы сформировать упакованную в хроматин искусственную хромосому. Они также изучили молекулярные механизмы, с помощью которых чужеродная ДНК размером в килобазы может быть собрана в искусственную хромосому размером более 10 мегабаз у C. elegans.

Что такое искусственные хромосомы и почему они важны для медицины?

Наша ДНК тщательно упакована белками в хроматин. Если ДНК — это нить, то белки — это катушки, на которые она наматывается, чтобы оставаться организованной внутри микроскопической клетки. Но что произойдет, если в клетку попадет чужеродная "голая" ДНК-нить без катушек? Клетка способна снабдить эту новую нить собственными "катушками", позволяя ей стабильно сохраняться в клеточной среде как часть нового клеточного репертуара. Этот процесс называется формированием искусственной хромосомы.

Одно из самых перспективных применений ИХ — генная терапия. Например, смертельное хроническое заболевание легких — муковисцидоз — вызвано мутацией в гене CFTR и пока неизлечимо. Ученые изучают возможность использования бактериальных и дрожжевых искусственных хромосом (BAC и YAC) в качестве вектора для экспрессии нормального, функционального гена CFTR и преодоления дефектной экспрессии CFTR в клетках пациентов.

Чтобы создавать искусственные хромосомы, необходимо сначала понять, как они формируются и поддерживаются.

Как формируются новые хромосомы и роль центромеры

Ежедневно в организме человека делится почти два триллиона клеток. Каждая из них должна сделать свою идеальную копию. Цена ошибки деления — рак, для которого часто характерна нестабильность хромосом. Важную роль в точном наследовании хромосом во время деления клетки играет центромера.

Центромера — это специализированный участок на каждой хромосоме, который соединяет хромосому с микротрубочками веретена деления для управления расхождением хромосом. В некоторых раковых клетках центромеры могут инактивироваться или теряться из-за хромосомных перестроек, и тогда клетка может обойти потерю хромосомы, сформировав новую центромеру на случайном участке. О формировании новых центромер (неоцентромер) известно мало, хотя этот процесс связан с нестабильностью хромосом и может быть драйвером опухолеобразования. Его сложно изучать, так как неоцентромеры обычно обнаруживают уже после их формирования и стабилизации, при геномном анализе в связи с нарушениями развития или раком.

Для изучения формирования центромер команда доктора Юэнь использовала прямой метод — микроинъекцию, разработанную почти 30 лет назад. У многих видов, включая человека, чужеродная ДНК распознается и в основном исключается как механизм самозащиты. Удивительно, но C. elegans — один из редких видов, который позволяет чужеродной ДНК, полностью лишенной собственных последовательностей C. elegans, сливаться в крупную искусственную хромосому размером в мегабазы. В то время как C. elegans может построить искусственную хромосому без собственных последовательностей, другие искусственные хромосомы, например, человеческие (HAC), для построения и размножения требуют наличия некоторых последовательностей ДНК человека.

Команда разработала флуоресцентную систему для визуализации искусственных хромосом в реальном времени in vivo. Лаборатория использует этот анализ сегрегации ИХ в качестве функционального показателя формирования центромеры de novo (с нуля) для изучения факторов, влияющих на этот процесс. Доктор Линь определил, что шаперон гистонов RbAp46/48^LIN-53 и ацетилтрансфераза HAT-1 необходимы для формирования центромеры. C. elegans служит удобной моделью благодаря прозрачным эмбрионам, облегчающим визуализацию, а также своей уникальной способности эффективно индуцировать формирование центромер de novo и точно сегрегировать новые искусственные хромосомы в течение всего нескольких клеточных циклов в эмбрионах.

Текущие исследования дают новое представление о хромосомных процессах, необходимых для формирования центромер de novo и поддержания хромосом. Команда доктора Юэнь раскрыла биологические процессы in vivo, необходимые для превращения экзогенной ДНК в стабильно размножающуюся искусственную хромосому, и определила иерархию сборки центромеры de novo из фрагментов чужеродной ДНК. Команда также исследовала, можно ли управлять этим уникальным свойством C. elegans, манипулируя составом, сложностью и длиной последовательности ДНК, чтобы наблюдать предпочтения для построения искусственной хромосомы.

Используя эти подходы, теперь можно наблюдать и систематически сравнивать, как новая центромера устанавливается на искусственной хромосоме и как поддерживается существующая центромера на собственных хромосомах C. elegans.

Могут ли искусственные хромосомы у червей стать ответом для генной терапии?

Хотя порядок расположения генов на хромосоме может быть консервативным у близкородственных видов, репозиционирование центромер также происходит в ходе эволюции. Таким образом, процесс формирования новых центромер может быть как драйвером заболеваний, так и маркером эволюции.

Результаты этих исследований могут помочь продвинуть область синтетической биологии, исследуя, как можно оптимизировать формирование искусственной хромосомы, повышая эффективность образования центромер de novo и точность сегрегации. Это улучшит применение ИХ в качестве векторов большой емкости для клонирования и генной терапии.