Инженерные кольцевые РНК (circRNA) для улучшенной продукции белка
Кольцевые рибонуклеиновые кислоты (circRNA) — это перспективная платформа для исследований экспрессии генов как стабильная и распространённая РНК в эукариотических клетках, образующаяся в результате обратного сплайсинга. В новом отчёте, опубликованном в Nature Biotechnology, Роберт Чен и междисциплинарная команда исследователей из Стэнфордского университета (Калифорния, США) разработали систематический подход для быстрой сборки и тестирования элементов, влияющих на продукцию белка на основе синтетических кольцевых РНК. Команда максимизировала трансляцию circRNA, оптимизировав тонкие элементы, что позволило улучшить выход кольцевой РНК в несколько сотен раз. Результаты обеспечили повышенную трансляцию целевой РНК по сравнению с уровнями матричной РНК (mRNA) и обеспечили длительную трансляцию in vivo.
Разработка кольцевой РНК (circRNA) в лаборатории
Терапии на основе РНК охватывают матричную РНК (mRNA), малые интерферирующие РНК (siRNA) и микроРНК (miRNA) и расширяются в современной медицине, включая малые молекулы, биологические препараты и клеточную терапию. Например, недавно популярные mRNA-вакцины можно спроектировать в лаборатории и быстро разработать для реагирования на развивающиеся и срочные медицинские кризисы. Кодирующие РНК могут быть циркуляризованы в circRNA для продления длительности трансляции белка на основе молекул РНК, ковалентно соединённых "голова к хвосту". Биоинженеры также продвинули синтез длинных циркулярных транскриптов в circRNA. Однако фундаментальные механизмы инициации трансляции для образования кольцевой или матричной РНК различаются из-за отсутствия 7-метилгуанилатного (M7G) кэпа на кольцевых РНК. В результате исследователям необходимо тщательно изучить принципы трансляции circRNA, чтобы создать более эффективные терапии и потенциально превзойти трансляционные возможности mRNA. Для изучения этого аспекта команда разработала модульную платформу высокопроизводительного анализа для создания и тестирования синтетических кольцевых РНК с оптимизированной трансляцией и улучшенным выходом белка.
Модульная платформа сборки circRNA
Учёные разработали модульную платформу клонирования, состоящую из набора частей, совместимых с Golden Gate и Gibson-сборкой, что позволило проводить высокопроизводительное тестирование circRNA. Используя платформу, они определили, как конкретные аспекты дизайна кольцевой РНК влияют на её трансляцию. Например, команда ранее показала, как можно избежать иммунных ответов, запускаемых кольцевой РНК in vivo, путём модификации молекул m6A. Однако исследователям всё ещё необходимо понять влияние этого шага на трансляцию circRNA. Для решения этой задачи Чен и команда использовали свою платформу клонирования и включили m6A. По сравнению с немодифицированными circRNA, те, что содержали 5% m6A, показали равную трансляцию после трансфекции или электропорации in vitro. Таким образом, учёные экспериментально оценили влияние модификации на стабильность кольцевой РНК.
Раскрытие динамики circRNA для сильных результатов трансляции
Чтобы раскрыть принципы, лежащие в основе топологии вектора circRNA, необходимой для сильной трансляции, исследователи начали синтезировать circRNA для генерации вариантов с пептидами, закодированными в процессе. Основываясь на результатах, команда показала, что увеличение длины спейсера не было полезным для трансляции. Далее они показали, как 5' и 3' нетранслируемые области могут улучшить трансляцию circRNA. Исследователи также провели серию экспериментов по изучению оптимизации circRNA, а затем сравнили их в одном эксперименте. Они показали, как изменения постепенно увеличивали экспрессию circRNA без ущерба для выхода РНК или эффективности циркуляризации. Они также показали, как кинетика трансляции circRNA и mRNA значительно различается: circRNA требовалось более 24 часов, чтобы достичь максимальной длины трансляции, что намного превышало продолжительность трансляции mRNA. Затем они объединили серию оптимизаций circRNA, чтобы протестировать их экспрессию in vivo. Для доставки РНК команда формулировала их с помощью высвобождаемых транспортеров с изменяющимся зарядом (CARTs) или катионных молекул, опосредующих экспрессию mRNA на моделях мышей. Результаты показали, как созданные инженерным путём circRNA могут экспрессироваться с силой, аналогичной модифицированным РНК in vivo, хотя и с большей продолжительностью.
Перспективы
Таким образом, Роберт Чен и коллеги показали, как циркуляризация РНК обладает большим потенциалом для преобразования РНК-препаратов за счёт увеличения долговечности относительно высокотранзиентных молекул. Учитывая фундаментальные различия между механизмами трансляции circRNA и mRNA, существующие знания о максимизации трансляции mRNA не обязательно применимы к circRNA. Для облегчения этого исследования команда создала модульную платформу клонирования circRNA для тестирования многочисленных вариаций последовательностей и оптимизации множества параметров. Используя платформу, они определили несколько подходов к улучшению трансляции белка из circRNA с приложениями для широкой инженерии РНК, чтобы производить больше белка, чем mRNA in vitro, и демонстрировать большую долговечность своей трансляции in vivo и in vitro. Учёные систематически проанализировали элементы, регулирующие трансляцию circRNA, чтобы затем оптимизировать интересующие области для увеличения выхода белка circRNA для длительного производства белка in vivo.