Определение структуры малых РНК может помочь в разработке новых терапевтических средств
Новый метод позволяет исследователям определять структуру и количество «транспортных РНК» (тРНК) — небольших, высокоструктурированных и химически модифицированных РНК, участвующих в производстве белка — в живых клетках. Неправильное сворачивание тРНК связано с человеческими заболеваниями, от рака до диабета 2-го типа и неврологических расстройств. Новый метод, который также показывает, как структура тРНК может меняться при стрессе клеток от высоких температур, может потенциально помочь в разработке терапевтических средств для заболеваний, связанных с РНК, и применим к другим малым, высокомодифицированным типам РНК.
Статья, описывающая метод, разработанный исследователями из Университета Пенсильвании, опубликована на этой неделе в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences.
Преодоление сложностей работы с малыми РНК
«Около восьми лет назад наша команда разработала метод "Structure-seq", который использует химические модификации и высокопроизводительное секвенирование для определения структуры матричных РНК in vivo, — сказал Филип Бевилаква, руководитель исследовательской группы. — Мы расширили этот метод, чтобы преодолеть сложность работы с малыми РНК, которые имеют очень стабильные структуры и естественным образом сильно модифицированы химическими метками, как тРНК».
Принцип метода
Общая структура тРНК была определена в 1960-х и 70-х годах и классически описывается как трилистник. Структуры жизненно важны для их функции доставки аминокислот к месту производства белка в клетке.
«Мы можем предсказать структуру молекул РНК на основе их последовательности и путем модификации молекул химическим диметилсульфатом (DMS), — объяснил Рёта Ямагами, один из авторов исследования. — Поскольку тРНК малы и уже высокомодифицированы, что может вызывать проблемы при секвенировании, нам пришлось разработать методы, чтобы гарантировать захват молекул полной длины».
В их методе живые клетки обрабатывают DMS, затем РНК экстрагируют из клеток и отбирают по размеру для выделения тРНК. Для секвенирования необходимо создать ДНК-копии молекул РНК. Для этого к одному концу молекул РНК сначала присоединяют небольшие сегменты ДНК, называемые праймерами. Затем ДНК-копии создают с использованием специальной версии фермента «обратной транскриптазы», которая при определенных условиях не останавливается на химически модифицированных нуклеотидах, а вместо этого часто вносит ошибки при их встрече. Исследователи затем используют эти ошибки для идентификации модифицированных нуклеотидов — процесс, называемый «мутационным профилированием», — чтобы помочь в предсказании структуры.
«С этим методом мы получаем высокоточные предсказания структуры на уровне отдельных молекул, — сказал Бевилаква. — Это также позволяет нам определять количество каждого типа тРНК в клетке и наличие некоторых естественных модификаций».
Реакция на стресс и перспективы
Исследователи провели эксперименты на бактериальных клетках, культивируемых при нормальных температурах, при высокой температуре (тепловой стресс) и при кратковременном воздействии высокой температуры (тепловой шок). В условиях как теплового стресса, так и шока несколько типов молекул тРНК неправильно сворачивались, а относительное количество и форма разных тРНК менялись.
«Концепция, что даже высокоструктурированная РНК, такая как тРНК, конформационно реагирует на условия окружающей среды, — это захватывающее открытие данного исследования, — сказала Сара М. Ассманн, соавтор исследования. — Это расширяет наше базовое понимание того, как клетки реагируют на окружающую среду и стресс».
Новый метод, названный «tRNA structure-seq», можно использовать для изучения структуры малых РНК, связанных с человеческими заболеваниями, и он не ограничивается тРНК.
«Наблюдение за тем, как молекулы тРНК реагируют на эти стрессы и не только, поможет нам лучше понять, как клетки реагируют на стресс, а также может помочь понять заболевания, связанные с неправильным сворачиванием тРНК, — сказал Бевилаква. — Этот новый метод преодолевает трудности работы с малыми, высокомодифицированными молекулами РНК и может быть применен к любому организму и к другим малым РНК».