Mim-tRNAseq: метод для точного измерения количества и статуса модификаций разных тРНК

Транспортные РНК (тРНК) доставляют специфические аминокислоты к рибосомам во время трансляции матричной РНК в белки. Поэтому количество тРНК может оказывать глубокое влияние на физиологию клетки, но измерение количества каждой тРНК в клетках было ограничено техническими сложностями. Исследователи из Института биохимии Макса Планка преодолели эти ограничения с помощью mim-tRNAseq — метода, который можно использовать для количественного определения тРНК в любом организме и который поможет улучшить наше понимание регуляции тРНК в здоровье и болезни.

Клетка содержит несколько сотен тысяч молекул тРНК, каждая из которых состоит всего из 70–90 нуклеотидов, сложенных в узор, напоминающий лист клевера. На одном конце тРНК несут одну из двадцати аминокислот, служащих строительными блоками белка, в то время как противоположный конец спаривается с кодоном, специфицирующим эту аминокислоту в матричной РНК во время трансляции. Хотя существует всего 61 кодон для 20 аминокислот, клетки разных организмов могут содержать сотни уникальных молекул тРНК, некоторые из которых отличаются друг от друга всего одним нуклеотидом. Многие нуклеотиды в тРНК также украшены химическими модификациями, которые помогают тРНК сворачиваться или связывать правильный кодон.

Уровни отдельных тРНК динамически регулируются в разных тканях и во время развития, а дефекты тРНК связаны с неврологическими заболеваниями и раком. Молекулярные истоки этих связей остаются неясными, поскольку количественное определение количества и модификаций тРНК в клетках долгое время оставалось сложной задачей. Команда Дэнни Недиалковой из Института биохимии Макса Планка разработала mim-tRNAseq — метод, который точно измеряет количество и статус модификаций разных тРНК в клетках.

Препятствия, создаваемые модификациями, и их преодоление

Для одновременного измерения уровней нескольких РНК ученые используют фермент, называемый обратной транскриптазой, чтобы сначала переписать РНК в ДНК. Затем миллионы этих копий ДНК можно количественно определить параллельно с помощью высокопроизводительного секвенирования. Переписывание тРНК в ДНК было чрезвычайно трудным, поскольку многие модификации тРНК блокируют обратную транскриптазу, заставляя ее останавливать синтез ДНК.

«Многие исследователи предлагали элегантные решения этой проблемы, но все они устраняют лишь часть препятствий, создаваемых модификациями в тРНК», — объясняет Дэнни Недиалкова, руководитель исследовательской группы Макса Планка. «Мы заметили, что одна конкретная обратная транскриптаза, казалось, была намного лучше в чтении через модифицированные сайты тРНК. Оптимизировав условия реакции, мы смогли значительно повысить эффективность фермента, позволив ему читать через почти все препятствия, создаваемые модификациями тРНК», — добавляет Недиалкова. Это позволило создать библиотеки ДНК из полноразмерных копий тРНК и использовать их для высокопроизводительного секвенирования.

Вычислительный инструментарий mim-tRNAseq

Анализ полученных данных секвенирования также представлял значительные трудности. «Мы выявили две основные проблемы: первая — это обширное сходство последовательностей между разкими транскриптами тРНК, — объясняет Эндрю Беренс, аспирант в группе Недиалковой и первый автор статьи. — Вторая заключается в том, что во время обратной транскрипции на многих модифицированных сайтах вводится неправильный нуклеотид (неправильное включение). И то, и другое чрезвычайно затрудняет отнесение каждого прочитанного фрагмента ДНК к молекуле тРНК, из которой он произошел», — добавляет Беренс.

Команда решала эти проблемы с помощью новых вычислительных подходов, включая использование аннотации модификаций для точного выравнивания прочтений. Получившийся комплексный инструментарий упакован в свободно доступный конвейер для выравнивания, анализа и визуализации данных секвенирования, полученных из тРНК. Исследователи могут использовать mim-tRNAseq не только для измерения количества тРНК, но и для картирования и количественного определения модификаций тРНК, которые вызывают неправильное включение нуклеотидов обратной транскриптазой. «mim-tRNAseq открывает множество возможностей на будущее, — говорит Недиалкова. — Мы ожидаем, что это поможет нам и другим решить многие нерешенные вопросы о биологии тРНК в здоровье и болезни».