Надежные часы для вашего микробиома

Исследование микробиома человека сталкивается с трудностью наблюдения за его изменениями во времени. Стандартный метод анализа образцов кала теряет информацию о том, где и когда происходят бактериальные изменения в кишечнике.

Новый инструмент, созданный учеными из Wyss Institute и Harvard Medical School (HMS), решает эту проблему. Он представляет собой набор генетически модифицированных бактериальных генов, которые могут детектировать и записывать изменения в росте разных популяций бактерий с течением времени в кишечнике живых мышей с точностью до одной клетки. Исследование опубликовано в Nature Communications.

Как работают генетические часы

Система использует осциллирующую генную цепь — репрессилятор — в качестве генетических часов для измерения бактериального роста. Репрессилятор состоит из трех бактериальных генов, кодирующих три белка (tetR, cl и lacI). Каждый белок блокирует экспрессию другого, образуя петлю отрицательной обратной связи.

Когда бактерия делится, концентрация репрессорных белков в цитоплазме разбавляется. При падении ниже порогового уровня запускается экспрессия следующего белка в цикле. Ключевое свойство: один цикл репрессилятора повторяется каждые 15.5 бактериальных поколений, независимо от скорости роста. Это делает его объективной мерой времени, подобно часам.

"Наш репрессилятор — это как часы, которые всегда идут с одной скоростью... Это позволяет нам точнее изучать поведение бактерий в кишечнике", — объяснил первый автор Дэвид Риглар.

Исследователи связали каждый из трех белков-репрессоров с флуоресцентной молекулой разного цвета. Они разработали метод визуализации RINGS (Repressilator-based Inference of Growth at Single-cell level), который отслеживает, какой белок экспрессируется в разные моменты времени.

"По мере роста бактериальной колонии репрессилятор создает различные флуоресцентные "годичные кольца"... Узор этих колец записывает, сколько циклов репрессилятора произошло с начала роста", — сказал Риглар.

С помощью RINGS команда успешно отследила деление клеток у нескольких видов бактерий in vitro. Длина цикла репрессилятора оставалась постоянной даже при росте на образцах кишечника мыши или при воздействии антибиотика.

Отслеживание изменений в живом организме

Для оценки работы репрессилятора in vivo команда ввела мышам перорально E. coli, содержащую генную цепь. Репрессилятор оставался активным до 16 дней после введения, демонстрируя возможность долгосрочной осциллирующей экспрессии генов в кишечных бактериях млекопитающих.

Анализ RINGS успешно выявлял изменения в паттернах роста. Более того, репрессиляторы бактерий, находившиеся на разных стадиях цикла, можно было синхронизировать, добавляя в питьевую воду мышей соединение, останавливающее цикл на заданной стадии.

В финальном тесте репрессилятор использовали для детекции различий в скорости роста бактерий, вызванных воспалением кишечника. Мышам вводили воспалительное соединение, а затем бактерии с репрессилятором. Через 15 часов анализ RINGS показал, что у бактерий от мышей с воспалением репрессиляторы находились в более широком диапазоне фаз по сравнению с контрольной группой. Это говорит о том, что воспаление создает среду, вызывающую неоднородность бактериального роста, что потенциально ведет к дисбалансу микробиома.

"Этот репрессилятор позволяет нам исследовать тонкости бактериального поведения в живом кишечнике... Факт, что мы можем повторно синхронизировать его, уже находящийся в кишечнике, означает, что мы можем изучать микробиом в более естественном состоянии", — сказала автор-корреспондент Памела Сильвер.

Помимо изучения динамики микробиома, репрессилятор открывает потенциал для создания сложных диагностических и терапевтических систем на основе синтетической биологии. Возможные применения: система, запрограммированная на запуск каскада транскрипции генов в определенный момент циркадного ритма, или диагностикум, записывающий время, прошедшее с момента детекции заданного биомаркера.

"Это исследование не только решает конкретную проблему мониторинга динамических изменений в физиологии микробиома, но и предоставляет платформу, которая может привести к созданию совершенно новых типов диагностики и даже зависящих от времени методов лечения", — сказал Дональд Ингбер.