Быстрый и эффективный метод детекции микроРНК

В начале 1990-х годов учёные, изучавшие развитие круглого червя, обнаружили небольшую молекулу РНК, регулирующую экспрессию определённых генов. Это ознаменовало открытие микроРНК (miRNAs), которые, как теперь известно, присутствуют во всех формах жизни. Эти молекулы играют ключевую роль во многих биологических процессах.

Позже исследователи выяснили, что заболевания могут нарушать экспрессию miRNAs, что подчеркнуло их потенциал в качестве биомаркеров. Аномальная экспрессия miRNA является отличительной чертой всех опухолевых заболеваний. Таким образом, методы детекции miRNA могут быть полезны для раннего выявления рака.

Однако miRNAs малы и легко деградируют, что затрудняет их быстрое обнаружение и количественное определение. Для детекции miRNA в образце обычно необходимо сначала их «амплифицировать». Проще говоря, это означает многократное копирование целевой miRNA с помощью биохимических процессов, чтобы её было легче обнаружить недорогими методами. К сожалению, большинство современных методов амплификации miRNA могут занимать более пяти часов, что ограничивает их использование в условиях point-of-care тестирования.

На этом фоне исследовательская группа, включая доцента Чжан Чуна из Университета Цинхуа, Китай, недавно разработала новую методологию для быстрой амплификации и детекции miRNA. Как объясняется в их последней статье, опубликованной в BioDesign Research, команда объединила два хорошо изученных биохимических метода в один, что значительно сократило общее требуемое время.

Первый использованный метод — амплификация по типу катящегося кольца (rolling circle amplification, RCA). В RCA идея заключается в создании кольцевой молекулы ДНК или «проб», к которой связывается целевой фрагмент РНК. Затем, после введения ферментов ДНК-полимеразы и необходимых строительных блоков ДНК, фрагмент РНК удлиняется путём добавления нуклеотидов, комплементарных кольцевой пробе. Этот процесс приводит к образованию длинной одноцепочечной молекулы генетического материала, содержащей множество копий кольцевой пробы.

Здесь вступает в действие второй метод — CRISPR-Cas12a. CRISPR-Cas12a — широко используемый генетический инструмент, в котором молекулярный комплекс создаётся для связывания с определённой последовательностью ДНК. В данном случае исследователи сконструировали комплекс так, чтобы он связывался с областью в комплементарной последовательности к кольцевой пробе.

То есть комплексы CRISPR-Cas12a связывались многократно вдоль одноцепочечной ДНК, полученной с помощью RCA. После связывания активировалась часть Cas12a, расщепляя флуоресцентную пробу от её гасителя. Это, в свою очередь, создавало легко обнаруживаемый флуоресцентный сигнал, который был тем ярче, чем больше была амплифицирована исходная целевая РНК.

Помимо комбинации этих методов, исследователи улучшили время реакции этапа RCA, используя «предварительно циркуляризованные пробы». В отличие от большинства стандартных процедур RCA, пробам придавали кольцевую форму до начала реакции.

Как отмечает профессор Чжан, это сделало процесс обнаружения намного быстрее без ущерба для производительности системы: «Обнаружение miRNA могло быть завершено всего за 70 минут, а не за обычные пять часов, с отличным пределом обнаружения 8.1 pM и очень высокой специфичностью».

В целом, предложенный подход открывает светлое будущее для детекции miRNA и их использования в качестве биомаркеров. Профессор Чжан заключает: «Наша разработка повышает эффективность стратегий детекции на основе CRISPR–Cas и RCA и показывает большой потенциал для лабораторного обнаружения и тестирования у постели больного». Поскольку методы, используемые в этой методологии, не являются чрезмерно дорогими или сложными в выполнении, широкое внедрение предложенного подхода в клинических условиях вполне осуществимо.